靶向Ku70mRNA反义核酸的设计及其对Hela细胞辐射敏感性影响的研究

论文摘要

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,其发病率与死亡率高居女性生殖系统恶性肿瘤之首,严重威胁着女性的生命和健康。近年来的研究表明:宫颈癌的发生成呈年轻化趋势,而且腺癌所占比例明显升高,由于除早期癌外,宫颈癌的绝大多数治疗是手术和放疗/化疗的综合治疗,而宫颈腺癌对放射治疗不敏感,故预后不理想,因而寻找一种有效、适用的方法增强宫颈腺癌对辐射的敏感性成为妇科恶性肿瘤领域一项亟待解决的任务。DNA 双链断裂（DSB）是电离辐射所致的与细胞死亡关系最密切的一种损伤,DNA 损伤修复基因是决定细胞辐射敏感性的内在分子机理之一,DNADSB 修复水平与细胞辐射敏感性关系密切。Ku 异二聚体是参与DNA DSB 修复中非同源末端连接途径（NHEJ）的关键酶DNA-PK 的催化亚基,在DNA DSB 修复和V（D）J 重组中起关键作用,编码Ku 异二聚体的Ku 基因是人鼠同源基因。二聚体之一的Ku70 与细胞的电离辐射敏感性、化学药物敏感性、某些肿瘤的发生与进展、细胞凋亡以及衰老均有关系。诸多研究表明,Ku70 蛋白尤其与肿瘤细胞的辐射敏感性相关,有可能成为辐射增敏治疗的一个新的分子靶。本研究首先采用克隆形成法和MTT法建立了Hela细胞的辐射剂量-存活曲线;选择Ku70 mRNA 为靶点,用RNAdraw 软件模拟其二级结构,选择其二级结构上不稳定区域作为靶位,再根据Sfold 软件提供未配对碱基的可能性概率,筛选出未配对碱基出现概率高的序列为候选序列,以减少对结构预测准确性的误差,结合两种方法设计了6 个长20nt的反义寡核苷酸,经MTT 法筛选出对Hela 细胞的非特异性细胞毒作用最小的NO.1;再经脂质体转染法将NO.1 反义寡核苷酸导入Hela 细胞,

论文目录

• 缩略词表
• 前言
• 材料与方法
• 一、实验材料
• 二、实验方法
• （一）、人 Ku70 mRNA 序列的获得、二级结构模拟及反义寡核 苷酸的设计、合成
• （二）、细胞培养
• （三）、正常 Hela 细胞辐射剂量-存活曲线的建立:
• （四）、Hela 细胞 Ku70 基因表达检测:
• （五）、Ku70 反义寡核苷酸链转染 Hela 细胞（脂质体转染法）及 Ku70 反义寡核苷酸的非特异性细胞毒性检测。
• （六）、转染 Ku70 反义寡核苷酸后 Hela 细胞 Ku70 基因检测,紫外灯下照射、拍照。
• （七）、转染后 Hela 细胞辐射剂量-存活曲线的建立。
• （八）、数据统计
• 实验结果
• 一、靶向Ku70 mRNA 的反义寡核苷酸的设计
• 二、Hela 细胞辐射-存活曲线的建立
• 三、6 条反义寡核苷酸的体外筛选
• 四、NO.1 反义寡核苷酸对Hela 细胞Ku70 mRNA 表达的影响
• 五、NO.1 反义寡核苷酸对Hela 细胞辐射敏感性的影响
• 讨论
• 一、辐射所致细胞死亡的分子机理
• 二、DNA 辐射损伤修复与辐射敏感性的关系
• 三、反义核酸技术作用原理及意义
• 四、克隆形成法与MTT 分析法比较
• 五、NO.1 反义寡核苷酸在体外有效抑制Hela 细胞Ku70 mRNA 的表达
• 六、NO.1 反义寡核苷酸在体外有效增强Hela细胞的辐射敏感性
• 结论
• 文献
• 中文摘要
• 英文摘要
• 致 谢
• 导师简介
• 作者简介