以GFP为报告基因的多基因共表达慢病毒载体系统的构建

论文摘要

神经细胞的转基因技术是不仅是研究神经系统疾病的分子病理机制的重要手段,而且为神经系统疾病的基因治疗带来了新的希望。其关键之一就是选择良好的转基因载体。近年来慢病毒载体以其独特的优势而越来越被人们所关注。慢病毒载体（LV,lentiviral vector）来源于人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）,其致病基因已经被剔除,它能感染包括神经元在内的非分裂细胞、感染效率高、免疫原性低,可携带转基因整合到宿主细胞基因组内而长期稳定地表达所携带目的基因。因大多数神经系统疾病是由多个基因共同作用所致,故进行基因治疗时需要选择能够同时上调（强启动子驱动）目的基因或下调（siRNA基因沉默）多个靶基因的转基因载体。因此当前慢病毒载体研究的一个方向即是构建多基因共表达载体。此外,因为慢病毒感染宿主细胞时无明显的感染标记,故进行滴度测定时极为不便,目前尚缺快速稳定的滴度测定方法。针对上述问题,本研究利用分子克隆方法构建了一套多基因共表达慢病毒载体构建系统,此系统可用以构建多siRNA、报告基因GFP和目的基因共表达的慢病毒载体。可将GFP作为感染标记,采用标准的TCID50法计算病毒滴度,建立了一种方便快捷的慢病毒滴度测定方法,为神经系统疾病的研究和治疗建立了一个实用工具。目的:1.构建多个siRNA表达盒,GFP及目的基因共表达的慢病毒载体构建系统pLKO-M和pSi-shutle。2.和慢病毒包膜质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生表达GFP的慢病毒颗粒并建立慢病毒滴度的TCID50快速测定方法。方法:1.现有慢病毒载体pLKO-1-puro的多克隆位点的改建:设计并合成新的多克隆位点（AgeI、EcoRI、XbaI、SalI和MluI）序列,退火后连接到经AgeI和EcoRI双酶切的pLKO-1-puro载体质粒上,形成重组质粒pLKO-1-puro-MCS;转化大肠杆菌（escherichia coli,E.coli）DH5α感受态细胞,筛选阳性菌落、扩增后提取质粒,MluI和BamHI双酶切鉴定。2.CMV启动子-GFP-IRES-MCS元件克隆至pLKO-1-puro-MCS:以pGFP-IRES为模板设计引物,用高保真DNA聚合酶扩增出约2.4kb片段,XbaI和SalI酶切后克隆至pLKO-1-puro-MCS的XbaI和SalI位点处,XbaI和lSalI酶切鉴定。3.配套质粒pSi-shutle的构建:设计INPTEN1和INPTEN2引物,PCR扩增pSilencer2.0,得到421bp片段,将其克隆至pENTR-U6-con,得pSi-shutle,SalI和XbaI酶切鉴定阳性菌落。4.用脂质体2000将重组载体质粒PLKO-M、辅助质粒pCMV-dR8.2 dvpr和包膜质粒pCMV-VSV-G共同转染293T细胞,产生具有感染能力的慢病毒颗粒,在25000rpm、4℃条件下离心90min浓缩病毒颗粒。5.TCID50法测定慢病毒滴度:将病毒颗粒进行系列稀释后感染2个96孔板内Vero细胞,48小时后在倒置荧光显微镜下计数产生绿色荧光的孔数并计算滴度。结果:1.含新的多克隆位点（MCS）的寡核苷酸链被成功克隆到慢病毒载体质粒pLKO-1-puro中,得pLKO-1-puro-MCS,经过酶切鉴定证明构建成功。2.CMV启动子-GFP-IRES-MCS元件被成功克隆至pLKO-1-puro-MCS,酶切鉴定正确。3.pSilencer2.0质粒上的siRNA表达盒被成功克隆至pENTR-u6-con,酶切和测序鉴定正确。4.三质粒共转染293T 48小时后可见GFP表达,72小时后收获慢病毒颗粒并进行了浓缩。5.将浓缩后的病毒系列稀释后感染2个96孔板内Vero细胞,48小时后出现绿色荧光,用TCID50法计算得出浓缩后的病毒感染单位（IU）均值为6.47X106TU/ml。结论:1.成功构建了siRNA表达盒和GFP-目的基因共表达的慢病毒载体pLKO-M。2.成功构建了pLKO-M的配套质粒psi-shuttle,在其辅助下可以构建多siRNA、GFP和目的基因共表达的慢病毒载体3.建立了以绿色荧光作为感染标记,用TCID50法测定慢病毒滴度的方法。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 论文部分 以GFP为报告基因的多基因共表达慢病毒载体系统的构建
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述部分 慢病毒载体在神经系统疾病治疗中的应用研究进展
• 参考文献
• 附录部分
• 英文缩略词表
• 硕士期间发表文章
• 致谢