超氧化物歧化酶吸附分离—化学修饰耦合过程的研究

论文摘要

蛋白质分子修饰是蛋白类药物二次开发中的一项热点技术,可解决诸多蛋白类药物的应用问题,如稳定性差,半衰期短等,但修饰过程一般复杂,操作步骤多、周期长。本文以超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）为模板蛋白,探讨将分离过程和修饰过程耦合起来,从而获得活性高,稳定性更好的修饰SOD,并以此探求蛋白分离过程和修饰过程耦合的可行性。本文首先以DEAE 52为层析介质,研究了SOD阴离子交换吸附分离-PEG修饰耦合过程。研究结果表明,SOD最佳吸附条件:在pH7.8,温度25℃,溶液浓度1mg/ml、的吸附条件下,SOD吸附量达到5.3366x104U/g;固相SOD的最佳修饰条件:在25℃,pH9.2,50mmol/g硼砂-硼酸缓冲液中,mPEG与SOD的摩尔比为50:1;修饰后SOD的最佳洗脱条件:0-0.4 M NaCl梯度洗脱,流速为0.96mL/cm2·min。最终获得PEG-SOD的比活力:9638 U/mg,纯化倍数1.87倍,氨基修饰率:35.3%。然后,以自制Cu2+-葡聚糖凝胶G-75为层析介质,研究SOD金属螯合吸附分离-PEG修饰耦合过程。研究结果表明,SOD最佳吸附条件:在pH8.0,温度25℃,溶液浓度1.5mg/ml,Nacl浓度0.5M的吸附条件下,SOD吸附量达到9.69x104 U/g;固相SOD的最佳修饰条件:在25℃,pH9.2,100 mmol/L硼砂-硼酸缓冲液中,mPEG与SOD摩尔比为50:1;修饰后SOD的最佳洗脱条件:pH7.8,,25mmol/L磷酸缓冲液（0.5mol/L Nacl）洗脱杂蛋白后,再用pH6.0,25mmol/L磷酸盐缓冲液（0.5 mol/L Nacl,0.5 mol/L的NH4C1）洗脱SOD。最终获得PEG-SOD的比活:9067.8 U/mg,纯化倍数:1.755倍;氨基修饰率:40.9%,相比等量游离SOD的层析产品,活性保留:88.43%。最后,考察了修饰后SOD的部分性质,结果发现经修饰后的SOD稳定性获得了提高;同时通过对SOD新的修饰过程探讨,进一步论证了蛋白质吸附分离-化学修饰过程耦合的可行性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一章 绪论
• 1.1 蛋白类药物的研究概况
• 1.2 超氧化物歧化酶（SOD）的研究进展
• 1.2.1 SOD的种类和理化性质
• 1.2.2 SOD的催化机理
• 1.2.3 SOD类药物的应用
• 1.2.4 SOD的化学修饰
• 1.3 耦合技术的研究概况
• 1.3.1 下游分离技术的集成化
• 1.3.2 生物反应-分离耦合技术
• 1.4 论文研究的目的、意义及研究内容
• 第二章 SOD离子交换吸附—PEG修饰耦合工艺的研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试剂
• 2.2.2 仪器
• 2.2.3 实验原理
• 2.2.4 检测方法
• 2.2.5 实验方法
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 标准曲线
• 2.3.2 DEAE-52吸附条件的考察
• 2.3.3 固定化SOD修饰条件的考察
• 2.3.4 耦合过程中洗脱条件的考察
• 2.4 小结
• 第三章 SOD金属螯合亲和层析-EG修饰耦合工艺的研究
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试剂
• 3.2.2 仪器
• 3.2.3 实验原理
• 3.2.4 检测方法
• 3.2.5 实验方法
• 3.3 结果与讨论
• 2+-葡聚糖凝胶层析柱制备工艺的研究'>3.3.1 Cu²⁺-葡聚糖凝胶层析柱制备工艺的研究
• 3.3.2 Cu2+-葡聚糖吸附条件的考察
• 3.3.3 固定化SOD修饰条件的考察
• 3.3.4 SOD洗脱条件的考察
• 3.3.5 耦合过程中洗脱条件的考察
• 3.4 小结
• 第四章 PEG修饰SOD的稳定性研究
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试剂
• 4.2.2 仪器（同2.2.2）
• 4.2.3 实验方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 修饰前后热稳定性的比较
• 4.3.2 修饰前后耐酸性的比较
• 4.3.3 修饰前后耐碱性的比较
• 4.3.4 修饰SOD对胃蛋白酶的抵抗力
• 4.4 小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录 作者在攻读硕士学位期间发表的论文