支链氨基酸转氨酶产生菌的筛选及其发酵条件的优化

论文摘要

支链氨基酸转氨酶能够专一性地利用支链氨基酸进行转氨反应,在α-酮酸的合成、手性氨基酸对映体的拆分和氨基酸的生物合成等领域具有潜在的应用价值,其研究已受到国内外的广泛重视。本文系统开展了关于产酶菌株筛选,发酵产酶条件、转氨反应条件优化和产酶菌的生长动力学的研究,为深入开展支链氨基酸转氨酶的工业应用奠定了基础。本研究通过对公厕附近的土壤样品进行筛选,由筛选平板分离到274株菌落较大的菌株,验证转化产物后得到14株进入复筛,选出一株支链氨基酸转氨酶活性相对较高的菌株WJ44。通过对菌落形态的观察、16S rRNA序列的比对和系统发育分析、生理生化实验,鉴定WJ44菌株为一株蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）,命名为Bacillus cereus WJ44。通过单因素实验和响应面实验确定了Bacillus cereus WJ44发酵产支链氨基酸转氨酶的最佳培养基组成为:葡萄糖20.99 g/L,蛋白胨16.85 g/L,牛肉膏5 g/L,玉米浆18.24 g/L,KH2PO4 3 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L;最佳培养条件为:初始pH 7.0,培养温度37℃,装液量20 mL/250 mL三角瓶,摇床转速200 r/min,接种量3%。WJ44菌株在最佳培养基组成和培养条件下培养10 h,其支链氨基酸转氨酶活力即可达45.79 U/mL,菌体干重8.64 g/L,分别比原来提高了40%与10%,是一株产酶和生长性能较佳的菌株。利用单因素实验和正交实验确定了全细胞酶催化的的转氨反应的最佳条件为:底物L-亮氨酸15 g/L,丙酮酸12 g/L,酶液与底物溶液的配比1:1（V:V）,表面活性剂十六烷基三甲基溴化铵3 g/L,辅酶5’-磷酸吡哆醛0.04 mmol/L,转氨反应温度40℃,底物溶液起始pH 9.0。金属离子对转氨反应均有一定程度的抑制作用,Cu2+的抑制作用尤为明显。在最佳条件下转氨反应8 h,产物α-酮异己酸浓度即可达5.63 g/L。通过对Bacillus cereus WJ44在连续培养中的生长动力学特性研究,发现以葡萄糖为限制性底物时,WJ44菌株的比生长速率和限制性底物的浓度符合Monod方程。其最大比生长速率μmax = 0.438 h-1,饱和常数Ks = 0.510 g·L-1。最大菌体生产率（DX）m = 0.909 g·（L·h）-1,最佳理论稀释速率Dm = 0.388 h-1,基质得率系数Y x/s = 0.159 g·g-1,维持系数m = 0.0249 g·（g·h）-1。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 转氨酶的概念
• 1.2 支链氨基酸转氨酶
• 1.2.1 支链氨基酸转氨酶的酶学性质
• 1.2.2 支链氨基酸转氨酶的表达形式
• 1.2.3 支链氨基酸转氨酶的结构特性
• 1.2.4 支链氨基酸转氨酶的作用机理
• 1.2.5 支链氨基酸转氨酶的生理作用
• 1.3 支链氨基酸转氨酶的工业应用
• 1.3.1 α-酮酸的合成
• 1.3.2 手性氨基酸对映体的拆分
• 1.3.3 氨基酸的生物合成
• 1.4 本论文的研究意义、目的和内容
• 1.4.1 研究意义
• 1.4.2 研究目的
• 1.4.3 研究内容
• 第二章 支链氨基酸转氨酶产生菌的筛选和鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 土样
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液的配制
• 2.1.6 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 支链氨基酸转氨酶产生菌的筛选
• 2.2.2 产酶菌株WJ44 的鉴定
• 2.3 本章小结
• 第三章 Bacillus cereus WJ44 摇瓶发酵条件的优化
• 3.1 材料与试剂
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 实验方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 种龄的测定
• 3.2.2 发酵产酶进程曲线
• 3.2.3 发酵培养基的优化
• 3.2.4 培养条件的优化
• 3.2.5 优化后摇瓶发酵产酶曲线
• 3.3 本章小结
• 第四章 Bacillus cereus WJ44 催化的转氨反应研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 转氨反应底物溶液
• 4.1.5 实验方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 α-酮异己酸-峰面积标准曲线
• 4.2.2 温度对转氨反应的影响
• 4.2.3 pH 对转氨反应的影响
• 4.2.4 酶浓度的选择
• 4.2.5 L-亮氨酸浓度对转氨反应的影响
• 4.2.6 丙酮酸浓度对转氨反应的影响
• 4.2.7 表面活性剂对转氨反应的影响
• 4.2.8 金属离子对转氨反应的影响
• 4.2.9 辅酶对于转氨反应的影响
• 4.2.10 最佳转氨反应条件的确立
• 4.2.11 Bacillus cereus WJ44 的转氨反应曲线
• 4.3 本章小结
• 第五章 Bacillus cereus WJ44 在连续培养过程中的生长动力学研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 DNS 试剂的配制
• 5.1.4 连续培养的装置
• 5.1.5 实验方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 分批培养阶段细胞生长与底物消耗情况
• 5.2.2 连续培养实验结果
• 5.2.3 连续培养有关参数的估算
• 5.2.4 稀释率与菌体浓度及残糖浓度的关系
• 5.2.5 菌体生长模型
• 5.2.6 稀释率与菌体生产率的关系
• 5.2.7 限制性基质葡萄糖的消耗与细胞生长、维持的关系
• 5.3 本章小结
• 第六章 结论与展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文