重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白疫苗的制备及免疫效果评价

论文摘要

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, SA）是一种重要的人畜共患病原菌,革兰氏染色阳性,可引起多种严重感染。由于抗生素的滥用,特别是耐甲氧西林菌株的迅速蔓延,使得依靠抗生素治疗金黄色葡萄球菌引起的相关疾病变得越来越不可靠,疫苗是预防感染的有效手段,有望解决金黄色葡萄球菌感染这一棘手问题。本研究根据金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的空间结构模型,对其进行了三位点突变、密码子优化后导入原核表达系统进行表达、纯化,并进行了动物免疫保护试验,取得了以下结果:（1）于GenBank中查得SEB全序列,根据其空间结构模型,进行三位点突变,经密码子优化、序列合成后成功获得rSEB基因序列。（2）将合成后的基因序列经Nde I和Hind III双酶切,并与经同样酶切的pET-22b表达载体进行连接,通过PCR扩增、双酶切鉴定及核苷酸测序证实原核表达载体构建成功。（3）为了促使目的蛋白以可溶性形式表达,对诱导条件进行了一系列摸索及优化,如IPTG浓度、诱导时间、温度。经实验结果比较最终确定1 mmol/L IPTG 37℃诱导8小时为最优条件。对诱导的目的蛋白进行阴阳离子交换柱纯化、BCA蛋白定量及透析袋浓缩后使得所得目的蛋白浓度为10 mg/mL。（4）将所得目的蛋白免疫Balb/c小鼠,分注射剂型和滴鼻剂型。注射组以氢氧化铝为佐剂,免疫两次,滴鼻组以季铵化水凝胶为佐剂,免疫三次,每次免疫间隔两周。于每次免疫后一周尾静脉采血,分离血清并进行ELISA效价检测以评价rSEB蛋白疫苗的免疫原性。注射组二免两周后、滴鼻组三免两周后分别进行注射及滴鼻攻毒,并对攻毒后的小鼠取肝、脾、肺、肾作病理组织观察,以评价rSEB蛋白疫苗的保护效果。结果显示,无论是注射途径还是滴鼻途径,rSEB均具有较强的较强的免疫原性及良好的保护力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 金黄色葡萄球菌肠毒素B 的研究进展
• 1.1 金黄色葡萄球菌的病原学概况
• 1.2 金黄色葡萄球菌的流行病学
• 1.3 国内外疫苗研究概况
• 1.3.1 SA 荚膜多糖
• 1.3.2 PNAG
• 1.3.3 表面蛋白
• 1.3.4 毒素
• 1.3.5 胞外基质结合蛋白
• 1.4 SA 肠毒素B 的研究
• 1.4.1 肠毒素的分型
• 1.4.2 肠毒素B 的致病机制
• 1.4.3 肠毒素B 的特异性
• 1.4.4 肠毒素B 的中毒症状
• 1.4.5 肠毒素B 的发病机制与临床表现
• 1.4.6 肠毒素B 的流行病学研究
• 1.4.7 肠毒素B 的检测
• 1.4.8 金黄色葡萄球菌肠毒素B 与生物安全
• 1.4.9 金黄色葡萄球菌肠毒素B 中毒治疗及疫苗研究进展
• 1.5 结语
• 试验研究
• 第二章 重组金黄色葡萄球菌肠毒素B 蛋白在大肠埃希菌中的表达、纯化与鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 细菌与质粒
• 2.1.2 主要试剂与仪器
• 2.1.3 序列合成及引物设计
• 2.1.4 重组表达质粒的构建与鉴定
• 2.1.5 融合蛋白的表达
• 2.1.6 融合蛋白的纯化
• 2.1.7 融合蛋白的免疫印迹鉴定
• 2.1.8 目的蛋白rSEB 蛋白定量
• 2.1.9 蛋白浓缩
• 2.2 结果
• 2.2.1 SEB 基因序列的获得
• 2.2.2 重组表达质粒的构建
• 2.2.3 rSEB 目的蛋白的表达
• 2.2.4 蛋白的纯化
• 2.2.5 Western blot 鉴定
• 2.2.6 BCA 法蛋白定量
• 2.2.7 蛋白浓缩
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 重组金黄色葡萄球菌肠毒素B 蛋白疫苗免疫效果评价
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 抗体效价测定结果
• 3.2.2 毒素的制备及鉴定
• 3.2.3 攻毒前后抗体IgG 比较
• 3.2.4 抗体消长检测
• 3.2.5 病理组织切片
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 英文缩略词表
• 致谢
• 作者简介