论文摘要
研究背景和目的:日光所致的光损伤疾病一直是人们关注的一类热点疾病。日光中的紫外线是诱发光老化、光源性损伤,以及包括皮肤鳞状细胞癌、皮肤基底细胞癌、皮肤黑素瘤在内多种皮肤肿瘤的主要因素。中波紫外线（UVB）辐射造成光源性皮肤损伤的重要始动机制是:UVB能够直接引起皮肤细胞DNA损伤,即产生DNA光产物,其中主要为环丁烷嘧啶二聚体（CPDs）和6-4光产物（（6-4）PPs）。光产物形成后,细胞内重要的应激反应就是激活一系列下游信号通路,导致各种紫外线辐射相关效应的发生。关于UVB所致皮肤肿瘤发生的研究很多,但从小分子RNA（miRNAs）水平研究光致癌和光损伤尚处于起步阶段。Mi RNAs是一组新发现的（约19-24个核苷酸大小）非编码RNA,通过与3’非翻译区的相互作用作用于相应的靶基因信使RNA,继而调节基因的表达。迄今已有数百种miRNAs被发现,其中绝大多数呈高度进化保守的特点。据计算机预测,人类的miRNAs可能会超过1000种。据估计,在m RNA调节的蛋白编码过程中,miRNA介导的调节作用所占比例大于三分之一。Mi RNA对转录后基因表达的调控直接影响了细胞的生物学行为及蛋白质的表达。近来越来越多的报告证实了miRNA在皮肤及其附属器生长完善和稳态的保持中都起着关键的作用,失调的miRNA会导致一些皮肤疾病的产生。每个组织都有其特异的miRNA表达谱,皮肤是人体最大的器官,然而直到现在,仅仅只有一些皮肤特异的miRNAs被发现,对它们在皮肤生理学和病理学中的确切作用所知甚少。基因芯片具有快速、高通量筛查基因表达水平的优点,是研究不同时相、不同分化的组织细胞基因差异表达及动态表达的重要工具。目前,miRNAs资源己实现网络共享。利用网络资源及研制哺乳动物miRNAs检测芯片,将大大简化大规模筛选组织细胞中差异表达miRNAs的程序,为进一步分析miRNAs生物学功能奠定基础。随着更多的miRNAs被鉴定和进一步研究,已发现了miRNA在细胞生长、增殖、发育和凋亡过程中扮演重要角色,并与许多疾病的发生有关。然而目前尚无UVB诱导光损伤miRNA靶位点的研究报告,本篇研究的目的旨在通过基因芯片的筛选,找出与UVB照射HaCaT细胞发生光损伤中相关miRNA的差异表达,继而对其中感兴趣的miRNA在光损伤中的作用及可能的作用机制进行初步研究,为UVB引起急性光损伤在miRNA水平的探讨开辟一条新的研究思路。方法:1.首先采用HaCaT细胞建立UVB急性损伤模型,利用流式及免疫荧光的方法检测生理剂量30m J/cm2UVB照射后,30min及24h时的的细胞凋亡和CPDs产生及清除情况;2.采用Agilent公司的人类miRNA芯片检测30m J/cm2及60m J/cm2UVB照射4及24h后HaCaT细胞中miRNA的表达变化情况,采用q RT-PCR的方法对miRNA进行验证,进一步确认基因芯片结果;并采用聚类分析方法对筛选出的miRNA进行分析;3.采用实时定量PCR（q RT-PCR）方法检测miR-23a,miR-27a及miR-24表达簇在UVB照射后30min、4h、24h的表达量变化情况;4.设计合成了miR-23a、miR-27a及miR-24的模拟剂（mimics）、抑制剂（inhibitors）并转染进HaCaT细胞内,采用CCK-8法观察上调及下调各个miRNA表达水平后对UVB照射后HaCaT细胞增殖速率的影响;5.将miR-23a-mimics及miR-23a-inhibitors分别转染HaCaT细胞,选取UVB照射后30min及24h两个时间作为CPDs清除率的观察点,采用细胞免疫荧光法及斑点杂交法检测30m J/cm2UVB急性损伤后两个时间点细胞中CPDs的产生及清除情况;6.采用流式细胞术及Hoechst染色法检测30m J/cm2UVB急性损伤后24h时细胞中凋亡率变化,ELISA法检测凋亡相关的Caspase-3的含量变化情况;7.利用在线数据库Target Scan（http://www.targetscan.org/）,和miRanda（http://microrna.sanger.ac.uk/）等预测miR-23a靶基因,采用RNAhybrid（http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/）在线分析系统对miR-23a及选取出的相关靶基因基因片段的可能结合位点进行分析。结果显示其与TOP1存在两个可能的结合位点,分别位于TOP1基因序列上的638-645处及1020-1027处;与Caspase-7和STK4仅存在一个可能的结合位点;由于预测下游蛋白TOP1有两个可能的结合位点,我们采用了定点突变的方法来分别突变两个结合位点,通过双荧光素酶报告法来检测有效结合位点;8.选取了UVB照射后24h时间点,采用q RT-PCR及Western-Blot的方式来检测TOP1、Casapse-7、STK4基因及蛋白水平的变化情况。结果:1.UVB照射对HaCaT细胞凋亡率及CPDs产生及清除的影响HaCaT细胞在接受30m J/cm2的UVB照射后表现出了明显的凋亡率增加,以24h时最为明显;CPDs在30min时表达量最高,逐渐被清除,在24h时表达量较30min时明显下降。由此可见,30m J/cm2的UVB照射HaCaT细胞可引起细胞凋亡及CPDs的产生,其中凋亡率在24h内随着时间延长逐渐升高;CPDs产生以30min时最为明显,由于HaCaT细胞自身具有清除CPDs的能力,CPDs量逐渐减少。2.Mi RNA芯片筛选UVB照射后产生变化的miRNAs miRNA芯片结果显示与对照组细胞相比,在30或60m J/cm2的UVB照射后,显著数量的miRNAs表达出现了变化,在4h及24h两个时间点共有45个miRNAs表达水平的变化上调或下调超过2倍。q RT-PCR进一步证实了45个miRNAs中30个miRNAs的表达量变化情况和芯片的结果是一致的。采用Cluster and Tree View软件对筛选出的miRNAs进行聚类分析,由不同的时间点分为四组。（i）4h表达下调,24h回到正常或上调水平:hsa-miR-326,hsa-miR-423-5p,hsa-miR-193b,hsa-miR-542-5p;（ⅱ）4h表达上调,24h回到正常或下调水平:hsa-miR-26a,hsa-let-7c,hsa-let-7f,hsa-miR-487b,hsa-miR-26a-2,hsa-miR-543,hsa-miR-487b;（ⅲ）4h及24h表达上调:(hsa-miR-31,hsa-miR-24,hsa-miR-27b,hsa-let-7b,hsa-miR-200b,hsa-miR-125b,hsa-miR-27a,hsa-let-7g,hsa-miR-23a;hsa-miR-98,hsa-miR-221,hsa-miR-186,hsa-miR-30a,hsa-miR-22,hsa-miR-96,hsa-miR-16,hsa-miR-18b,hsa-miR-34a,hsa-let-7a,hsa-miR-93,hsa-miR-185,hsa-miR-197,hsa-miR-365,hsa-miR-23b,hsa-miR-29a;（iv）4h及24h表达下调:hsa-miR-489,hsa-miR-138-1,hsa-miR-138-2,hsa-miR-23a,hsa-miR-296-5p,hsa-miR-376b,hsa-miR-493,hsa-miR-126,hsa-miR-143。3.UVB照射对HaCaT细胞中miR-23a、miR-27a及miR-24表达水平变化的影响q RT-PCR的结果显示在接受30m J/cm2的UVB照射后同一表达簇上的miR-23a、miR-27a及miR-24表达水平都产生了变化,以4h时表达为最高峰,其中miR-23a及miR-27a的表达量在4h时上升,至24h时表达量下降至接近照射前正常水平,而miR-24的表达量在照射后一直高于正常水平。4.干预miR-23a、miR-27a及miR-24表达水平对UVB照射后HaCaT细胞增殖速率的影响CCK-8检测结果显示UVB照射后HaCaT细胞的增殖速率受到了明显的抑制,但在UVB照射后的miR-23a过表达细胞增殖速率出现了明显的恢复,并且这种增殖速率的恢复可以被低表达miR-23a所抑制。但在miR-27a及miR-24组没有出现类似的增殖速率恢复。5.干预miR-23a表达水平对UVB照射后HaCaT细胞CPDs产生及清除的影响HaCaT细胞在UVB照射后30min时可见较强CPDs表达,在照射后随着时间推移由于HaCaT细胞自身对CPDs的清除能力,在24h时CPDs的表达量会有所降低。Mi R-23a过表达组在UVB照射后24h时表现出了较正常HaCaT细胞更高的CPDs清除速率,但同时这种高清除速率在miR-23a低表达组中被抑制。6.干预miR-23a表达水平对UVB照射后HaCaT细胞凋亡率的影响UVB照射可引起HaCaT细胞凋亡率增加,而过表达miR-23a可以保护细胞,降低凋亡率,并且这种保护作用在miR-23a低表达组中被抑制。对Caspase-3的检测也出现了和细胞凋亡率一致的含量变化趋势:UVB照射可以引起Caspase-3活性增加,但过表达miR-23a可以降低其活化,低表达miR-23a会促进Caspase-3的活化作用。7.Mi R-23a下游靶点的生物信息学分析及相关重要靶点的观察研究经在线数据库及基因本体论预测分析发现了三个我们感兴趣且高保守度的靶基因STK4、Caspase-7和TOP1,其生物学功能主要与DNA复制、物质代谢及细胞凋亡有关,这些都是细胞生长发育所必须的。通过对靶基因生物学通路分析发现最相关的分别是急性髓细胞白血病相关基因、肾细胞癌相关基因、胰腺癌相关基因、结肠直肠癌相关基因、非小细胞肺癌相关基因、细胞粘附相关基因、MAPK和Erb B信号通路。通过在线软件分析可知miR-23a及TOP1的结合存在两个可能的位点,分别位于TOP1 3’UTR（638-645）及（1020-1027）的位置,与Caspase-7及STK4各存在一个可能的结合位点,分别位于Caspase-7基因序列的999-1006处及STK4基因的4500-4507处。通过双荧光素酶报告法检测结果显示miR-23a可以通过638-645区域明显降低TOP1的表达,638-645区域突变后,这种调控作用即消失。8.干预miR-23a表达水平对UVB照射后HaCaT细胞中TOP1/Caspase-7/STK4基因及蛋白表达的影响q RT-PCR的检测结果与Western-Blot的结果一致,均提示:TOP1、Casapse-7、STK4在UVB照射后24h都出现了明显的基因及蛋白表达量上调,而过表达miR-23a可明显抑制UVB诱导的TOP1、Casapse-7、STK4表达水平增加。而同时低表达miR-23a会促进其在基因及蛋白水平的表达。结论:本文的研究证实在HaCaT细胞中,miR-23a可减轻UVB诱导的细胞生长抑制、细胞凋亡,并加速光产物CPDs的清除。Mi R-23a通过调控与凋亡相关的Caspase-7及STK4、与DNA损伤修复有关的TOP1的表达发挥抗紫外线光损伤作用。