论文摘要
c-Cbl是一个“Ring Finger”类型的E3泛素化激酶,它能够与酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶结合并被磷酸化,磷酸化后的c-Cbl泛素化激酶活性被激活,使与其结合的酪氨酸激酶和受体酪氨酸激酶多聚泛素化降解。其中Src家族酪氨酸激酶的很多成员（Lyn,Fgr,Yes等）已被报道与c-Cbl结合并受它的泛素化降解调控。P-选凝素配体PSGL-1（P-selectin glycoprotein ligand-1,CD162）已被发现直接参与白细胞中P-选凝素介导的整合素活化过程,我们实验室以前的研究具体阐明了一条P-选凝素结合PSGL-1诱导活化整合素的信号通路,发现了与PSGL-1组成性结合的蛋白Naf1,以及Src和PI3K在通路中发挥关键作用。在这里,我们的进一步研究表明,c-Cbl泛素化激酶也参与到PSGL-1诱导活化整合素的信号通路中,并且通过调控活化的Src水平起到负反馈调控的作用,避免信号的过度持续活化。当P-选凝素和其配体PSGL-1结合时,可以通过激活Src激酶来磷酸化Naf1,然后富集PI3K的P85/P110亚基向下传递信号最终促使β2整合素活化,进而介导中性粒白细胞的粘附;活化的Src同时与c-Cbl结合,并磷酸化c-Cbl第700,731和774位酪氨酸残基来激活它的泛素化激酶活性,最后使活化的Src多聚泛素化和依赖蛋白酶体的降解。活化的Src水平因泛素化降解而下调后,其下游的Naf1和PI3K的活性也紧跟着被下调,使β2整合素活性降低,导致细胞粘附能力下降。进一步的研究发现,P-选凝素和PSGL-1的结合还促进了Src,c-Cbl和Naf1向Lipid raft小体的富集,以有利于向下游级联传递信号。而且抑制c-Cbl的表达或者过表达c-Cbl泛素化激酶活性缺失的突变体（第371位酪氨酸残基定点突变成苯丙氨酸）都能抑制c-Cbl的活性从而增加细胞的粘附能力。总之,我们的研究发现的c-Cbl介导的负反馈调控机制对P-选凝素结合PSGL-1诱导活化整合素的信号通路进行了很好的补充,更完善的阐明了有机体对炎症过程的精细调控,避免了信号的过度持续活化。对更加深入了解炎症反应的分子机理提供了有利帮助。在表皮生长因子（EGF）刺激时,表皮生长因子受体（EGFR）与其结合并发生二聚化,然后发生自身磷酸化的EGFR与c-Cbl通过其SH2保守结构域结合并使之磷酸化,被磷酸化的c-Cbl激活了泛素化激酶活性,泛素化EGFR的同时,富集胞浆中的CIN85和Endophilin复合物,并与Dynamin和Clathrin等一起使细胞表面向内凹陷脱落形成胞内小体,然后通过多种囊泡小体分选,一部分重新循环到细胞表明再次参与到信号传递中,其余的都通过溶酶体降解。研究发现,当EGFR中的磷酸化位点或泛素结合位点发生突变时,细胞内表皮生长因子受体的表达就会上调,从而造成组织的癌变。因此对EGFR活化后负调控的研究和阐明具体的抑制此负调控的机理十分重要。CIN85首先作为85kD大小的Cbl结合蛋白被发现,它的N端由3个SH3保守结构域组成,中间是一段富含脯氨酸的区域,C端是一段α螺旋状的卷曲螺旋。它的SH3结构域和富含脯氨酸的区域使它成为一个配体蛋白,参与很多蛋白间的结合传递信号,C端的卷曲螺旋和它的细胞定位和自身多聚化有关。近年来,CIN85参与负调控表皮生长因子受体信号的研究逐渐深入。我们通过酵母双杂交的方法筛选到一个SHKBP1基因,通过命名原则序列分析我们发现SHKBP1上存在两个富含脯氨酸的区段（PXXXPR）可以参与和CIN85的结合,免疫共沉淀实验和以SHKBP1作为“诱饵”进行酵母双杂交筛选都证实了SHKBP1和CIN85的结合,进一步的实验发现两者的结合可以竞争抑制c-Cbl和CIN85的结合,从而影响c-Cbl和CIN85复合物介导的EGFR信号活化后的负调控。我们发现SHKBP1可以抑制EGFR活化后的降解,并能上调EGFR活化后的下游转录因子的转录水平。我们的研究发现了一个可能的抑制EGFR信号活化后负调控的机制,为进一步的研究深入提供了一定的基础。PDCD2L（PDCD2 like）因为其和PDCD2一样在C端都含有一个PDCD2C保守结构域而得名,所以也被认为可能具有凋亡调节活性。但是我们前面的研究发现它在凋亡过程中对STAT蛋白没有影响,而且其本身的水平也基本没有变化,过表达PDCD2L后细胞的凋亡也没有增加,同时我们发现PDCD2L和PDCD2在炎症过程中具有一定的作用,过表达PDCD2L和PDCD2的细胞在LPS刺激下能抑制TNF-α的释放。所以我们通过Pull—down实验来筛选可能和PDCD2L结合的蛋白,以便能更好的研究PDCD2L的功能。我们共筛选到12种与PDCD2L有相互作用的蛋白,其中的两个为LDHA和LDHB。LDH有五种同工酶组成,它是一个四聚体,有LDHA和LDHB两个单体相互组合形成。LDHA和LDHB在哺乳动物的发育过程中表达并具有组织特异性,所以血清中的LDH水平和不同同工酶的分布可以作为炎症、肿瘤等病理进程的指示剂。我们通过免疫共沉淀实验证实了PDCD2L和LDHA/B的结合,并且也确认了并不是PDCD2L的PDCD2C结构域参与和LDHA/B的结合,进一步的实验对PDCD2L和LDHA/B的结合可能对炎症过程产生的作用正在展开。我们的研究将为探索PDCD2L的相关功能提供一些提示。
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