禽白血病病毒p27抗原的单克隆抗体制备及双抗体夹心ELISA检测方法建立

论文摘要

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）和禽肉瘤病病毒（ASV）群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称。存在于鸡上的ALV主要为A、B、C、D、E和J等亚群,其中A、B、J亚群为临床常见的外源性病毒,可造成各种肿瘤性死亡或生产性能的下降。ALV既可垂直传播,又能水平传播,种群净化是防止病毒持续存在的有效方法。p27是ALV基因组中gag基因编码的群特异性抗原,是病毒核心衣壳蛋白的主要成分。本研究制备了针对p27抗原的单克隆抗体,并建立一种双抗体夹心ELISA检测方法,为禽白血病的净化工作提供一种简便方法。本研究首先设计了一对针对p27基因的特异性引物,采用PCR方法扩增出本室分离保存的JS-9-09-Ch株ALV的p27基因并进行测序,上传序列至GenBank获得登录号为：JF911742。与ALV-J HPRS-103毒株（登录号：Z46390）p27基因序列比对,同源性为94.8%。对PCR产物进行纯化,然后克隆到pET-32a（+）和pGEX-6P-1载体,分别转化到BL21（DE3）和BL21菌株进行培养。挑选转化成功的阳性质粒菌株,用IPTG进行诱导表达,收获菌液进行超声波裂解,将沉淀和上清分开处理后作SDS-PAGE鉴定,在两种菌液上清中分别出现目的条带的表达,His-p27蛋白为43kDa, GST-p27蛋白为53kDa。用High-Affinity Ni-IDA Resin和High-Affinity GST Resin对目的蛋白His-p27和GST-p27分别进行纯化。将纯化后的GST-p27蛋白用弗氏完全佐剂乳化后免疫8周龄BALB/c小鼠,间隔两周加强免疫一次（第二、三次免疫用弗氏不完全佐剂）。第三次免疫后两星期用等量抗原（不加佐剂）加强免疫一次,三天后取小鼠脾细胞与骨髓细胞瘤细胞SP2／0融合。用纯化的His-p27蛋白包被ELISA反应板,对融合成功的杂交瘤细胞进行筛选。选取阳性孔进行亚克隆,共获得稳定分泌抗p27抗原的单抗杂交瘤细胞系5株,分别命名为3G6、4A11、4C7、4C9、7F4。以每只BALB/c小鼠腹腔注射50万个杂交瘤细胞的数量制备腹水。3G6、4A11效价为1:102400,4C7、4C9、7F4效价为1：204800。单抗3G6、4A11、4C7、4C9亚类为IgG1,7F4为IgG2b。5株单抗均具有良好的群特异性,仅与ALV-A、ALV-B、ALV-J反应,与感染鸡的NDV、IBV、REV无交叉反应。Western-blot和IFA试验结果表明,所获单抗针对ALV核衣壳蛋白p27抗原。采用竞争ELISA方法筛选出针对p27不同抗原表位的单抗7F4和4C7,分别采用Protein G和Protein A亲和层析方法进行纯化。应用方阵试验确定包被单抗7F4的最佳工作浓度为1μg/mL（1：1000稀释）,辣根过氧化物酶（HRP）标记单抗4C7（4C7-HRP）的最佳工作浓度为0.5μg/mL（1：200稀释）。建立的ELISA方法与ALV-A、ALV-B、ALV-J反应,与NDV、IBV、REV无交叉反应。检测His-p27蛋白敏感度可达到16ng/mL。与IDEXX禽白血病病毒抗原检测试剂盒比较对临床采集的182份鸡泄殖腔棉拭子样品的检出率,符合率为95.6%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 目录
• 文献综述
• 第一章 禽白血病病毒p27蛋白的原核表达及其单克隆抗体研制
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3 单抗制备
• 4 结果
• 5 讨论
• 第二章 双抗体夹心ELISA检测禽白血病病毒方法的建立
• 1. 材料
• 2. 方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 致谢