水稻标签库突变体筛选与分析

论文摘要

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一,同时也是单子叶植物和禾本科作物分子生物学研究的模式作物。目前水稻基因组序列测定工作已经基本完成,预测编码基因超过40,000个,但目前克隆的功能基因仅有几十个。大规模T-DNA标签库创建将成为高通量研究水稻基因功能的主要工具。本研究主要围绕正在构建的增强子捕获系和激活标签系两个突变体库开展工作。内容主要包括两种标签库的突变效率评估和突变体的筛选,以及建立了一套高效扩增水稻侧翼序列的方法。 以粳稻品种日本晴为转化受体建立了高效的农杆菌介导的转化体系,并利用此体系构建了近10万份独立的T-DNA插入标签系（基因激活标签系和增强子捕获标签系各5万份）,并获得了T2种子。对其中的部分突变体进行了初步的田间鉴定,获得有明显表型改变的突变体总共4,046份,突变频率为6%,包括株高（高、矮）、生育期（早开花、晚开花）、育性（部分不育和完全不育）、叶型（宽叶、窄叶、针叶）、叶色（白化、黄化、深绿）、分蘖力（单分蘖、少分蘖、多分蘖）、粒型大小（长粒、大粒、小粒、小胚乳、双胚）、种子颜色以及内外孚异常、模拟病斑等。另外,还筛选到一些特殊性状的突变体,如脆杆突变株系、无中脉突变体株系、穗发育受阻突变体,异时性等。 对增强子捕获标签系和激活标签系T1代表型变异的比较观察发现,二者具有明显表型变异的突变体分别达到5.42%和6.42%。考虑到我们两个群体的构建过程一直是平行进行的,除载体不同外所有的创制条件都是相同的,推测基因激活的效率应为二者之差,即1%,这个结果为进一步的T0代表型变异所验证。 利用改进的PCR—Walking方法,我们已经获得1000余条标签突变体插入位点侧翼序列,并对插入的位置进行了比较初步的分析,其中约有53%属于有效插入（插入在基因的编码区、内含子区或启动子区）。在我们的突变体库中我们已经发现了4个已经被报道的基因,其表型与前人报道的表型一致。尤其花期一直被认为是数量性状,日本科学家Masahiro Yano于2000年在Plant Cell上报道的克隆了花期相关的数量基因Hd1,但是我们发现在获得生育期相关的突变体中,有一早熟突变体,比对照野生型日本晴提前开花两个月,插入侧翼序列扩增与测定表明这个突变体是恰好是由于Hd1被破坏所造成的。我们现有5个侯选基因已经通过共分离得以确认,互补实验正在验证中。10个候选基因插入同一基因不同位点表型相似的。大田的跟踪调查正在同步进行当中。 通过以上分析,表明我们构建的水稻突变体库无论从容量上、突变体的数量上、标签位点的获得等方面都已初具规模,从4个已报道的基因来看,我们的标签突变体库是可以有效的用来进行规模化的水稻功能基因研究。

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 T-DNA插入突变体库和转座子插入突变体库概述
• 1.2 构建不同T-DNA插入突变体库的必要性
• 1.2.1 基因敲除技术的应用和局限性
• 1.2.2 基因捕获技术
• 1.2.3 激活标签技术
• 1.3 获得外源片段插入位点侧翼序列的方法
• 1.4 拟南芥和水稻插入突变体库研究进展
• 1.4.1 拟南芥插入突变体库研究进展
• 1.4.2 水稻插入突变体库研究进展
• 1.5 水稻突变体和基因分类及数量
• 1.5.1 营养器官相关的突变体与基因
• 1.5.2 生殖器官相关的突变体与基因
• 1.5.3 种子发育相关的突变体和基因
• 1.5.4 异时性
• 1.5.5 抗性和逆性
• 1.6 本研究的目的和技术路线
• 1.6.1 本研究的目的
• 1.6.2 技术路线
• 第二章 水稻T-DNA插入突变体库和逆转座子突变体库的构建
• 2.1 突变体库载体的选择
• 2.1.1 增强子捕获载体
• 2.1.2 激活标签载体
• 2.1.3 内源的逆转座子Tos17
• 2.2 水稻T-DNA插入突变体库的构建流程
• 2.3 水稻饱和突变标签系大小评估
• 第三章 水稻标签突变系表型鉴定
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 苗期与生长期突变体的筛选
• 3.1.2 特异突变体的筛选
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 两种T-DNA突变标签系的表型观察
• 3.2.2 两种T-DNA突变标签系表型比较与效率分析
• 1代的遗传规律'>3.2.3 两种T-DNA突变标签系T₁代的遗传规律
• 3.2.4 重要农艺性状的突变体发现
• 3.2.5 矮秆突变体的归类
• 3.2.6 粒型突变体的筛选
• 3.3 讨论
• 第四章 水稻突变体侧翼序列的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 DNA的提取和PCR扩增
• 4.1.2 侧翼序列的测定
• 4.1.3 侧翼序列的同源性比对
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Enhancer trapping与Activating tagging扩增效率比较
• 4.2.2 Enhancer trapping与Activating tagging插入到水稻基因组位点比较
• 4.2.3 Tos17插入水稻基因组位点分析
• 4.2.4 利用标签系克隆水稻基因
• 4.3 讨论
• 4.3.1 PCR—Walking的改进对水稻高效扩增侧翼序列的探讨
• 4.3.3 Tos17与T-DNA在水稻功能基因组研究中的比较
• 4.3.3 标签系克隆水稻基因展望
• 第五章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历