论文摘要
前言：难治性垂体腺瘤的治疗现状垂体腺瘤约占颅内肿瘤的15%,仅次于胶质瘤,发病率居颅内肿瘤第二位。虽然大部分垂体腺瘤是良性肿瘤,生长缓慢,局限于蝶鞍内呈膨胀性生长。但是约35%的肿瘤呈侵袭性生长,肿瘤组织向蝶鞍上方、前方生长,侵犯下丘脑、第三脑室及／或视神经；向两侧生长,侵犯双侧海绵窦、包绕颈内动脉等重要结构；向下方、后方生长,破坏鞍底甚至斜坡骨质。还有部分垂体腺瘤为不典型垂体腺瘤,生长极为迅速,多呈侵袭性生长,其特点为：细胞分裂增殖能力很强,Ki-67标记指数大于3%,P53免疫反应呈阳性。对于部分侵袭性垂体腺瘤,手术很难完全切除,且术后容易复发,肿瘤生长更加迅速,药物和放射治疗均难以控制肿瘤生长,我们将这部分垂体腺瘤统称为“难治性垂体腺瘤”。难治性垂体腺瘤恶性程度介于侵袭性垂体腺瘤和垂体腺癌之间,目前尚无有效治疗方法,预后极差,严重影响患者生存质量及生命。因此,针对难治性垂体腺瘤,新的治疗靶点和治疗方法亟待开发。第一部分：替莫唑胺联合PI3K/mTOR信号通路抑制剂治疗垂体腺瘤细胞系和垂体腺瘤GH3移植裸鼠模型的研究目的:难治性垂体腺瘤手术很难全部切除,且术后容易复发,药物和放疗均不能治愈或很难控制肿瘤生长。近年来,替莫唑胺作为一种挽救疗法,对难治性垂体腺瘤具有一定的治疗作用。然而,并非所有的垂体腺瘤对替莫唑胺治疗敏感,根据文献报道,仅有60%的垂体腺瘤对替莫唑胺治疗有效,还有部分垂体腺瘤对替莫唑胺治疗不敏感甚至产生替莫唑胺抵抗。PI3K/mTOR信号通路的高度活化与多种肿瘤的药物化疗耐药有关。有研究报道：PI3K/mTOR信号通路在部分侵袭性垂体腺瘤中高度激活。XL765是一种新型的PI3K/mTOR信号通路双重抑制剂,可以作为一种单独疗法或作为传统化疗药物的增敏剂对多种肿瘤治疗有效。本实验旨在探讨能否通过抑制PI3K/mTOR信号通路增加垂体腺瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。方法：分别检测替莫唑胺和XL765单药及替莫唑胺联合XL765对垂体腺瘤小鼠／大鼠细胞系（aT3-1,GH3和MMQ）的细胞增殖和凋亡的影响；同时评估了替莫唑胺和XL765单药及替莫唑胺联合XL765对GH3细胞移植裸鼠动物模型的肿瘤生长,生存周期及生长激素和泌乳素分泌水平的影响。结果：替莫唑胺联合XL765能协同地抑制垂体腺瘤细胞的增殖并促进细胞凋亡；同时能抑制GH3细胞移植裸鼠动物模型的肿瘤生长,显著延长荷瘤小鼠的生存周期,降低生长激素和泌乳素分泌水平。替莫唑胺联合XL765能显著降低mTOR和AKT的磷酸化水平,同时下调Bcl-2的表达水平。替莫唑胺联合XL765的治疗后剪切的PARP和BAX的表达水平及Caspase3/7的活性显著增加。结论：PI3K/mTOR信号通路抑制剂可以抑制垂体腺瘤细胞的活性,并促进细胞凋亡；抑制PI3K/mTOR信号通路能增加垂体腺瘤细胞对替莫唑胺的敏感性,其作用机制可能是通过抑制PI3K/mTOR信号通路并调节凋亡相关的蛋白表达。第二部分：乙胺嘧啶通过Cathepsin B和Caspase依赖的细胞凋亡途径增加垂体腺瘤细胞对替莫唑胺的敏感性目的：乙胺嘧啶是一种抗叶酸药物,除了治疗疟疾和弓形虫病,还可以作为一种抗肿瘤药物或替莫唑胺的增敏剂,对黑色素瘤具有一定的治疗作用。本课题旨在探讨：乙胺嘧啶是否可以单独用于垂体腺瘤的治疗或增强垂体腺瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。方法：分别检测替莫唑胺和乙胺嘧啶单药及替莫唑胺联合乙胺嘧啶对垂体腺瘤小鼠／大鼠细胞系（aT3-1, GH3, MMQ和ATt-20）的细胞增殖和凋亡的影响；同时评估了替莫唑胺和乙胺嘧啶单药及替莫唑胺联合乙胺嘧啶对GH3细胞移植裸鼠动物模型的肿瘤生长,生存周期及生长激素和泌乳素分泌水平的作用。结果：替莫唑胺联合乙胺嘧啶能协同地抑制垂体腺瘤细胞的增殖和侵袭能力,同时促进细胞凋亡。此外,替莫唑胺联合乙胺嘧啶能导致垂体腺瘤细胞停滞在G2期和S期,增加细胞DNA损伤,上调组蛋白H2AX的磷酸化水平,上调组织蛋白酶B, Bax和剪切的PARP表达水平；同时增强Caspase3/7,8,9的活性。而Bcl-2, MMP-2和MMP-9的表达水平在替莫唑胺联合乙胺嘧啶的治疗后显著下降。替莫唑胺联合乙胺嘧啶显著促进细胞色素C从线粒体内释放到细胞溶质中。替莫唑胺联合乙胺嘧啶能抑制GH3细胞移植裸鼠动物模型的肿瘤生长,显著延长动物模型的生存周期,降低生长激素和泌乳素分泌水平,而不增加对荷瘤小鼠的毒副作用。结论：乙胺嘧啶单用可以抑制垂体腺瘤细胞活性并促进细胞凋亡；乙胺嘧啶可能通过促进组织蛋白酶B依赖的和Caspase依赖的凋亡途径来增强垂体腺瘤细胞对替莫唑胺敏感性；我们的研究也为难治性垂体腺瘤的治疗提供了新的治疗理念。第三部分：叶酸受体介导的硼中子俘获疗法治疗难治性无功能垂体腺瘤细胞的研究目的：难治性无功能垂体腺瘤手术很难全部切除,且术后经常复发。目前,临床上尚无有效药物能控制肿瘤生长。虽然放疗对肿瘤生长有一定抑制作用,但起效较慢,且常常导致严重的并发症。硼中子俘获疗法是一种新型的二元靶向放射疗法,能最大程度杀伤肿瘤细胞而对正常组织损伤较小。叶酸受体靶向的含硼碳纳米颗粒是一种新型的硼携带剂,能通过叶酸受体介导的细胞内吞作用被表达叶酸受体的细胞选择性摄取。我们前期研究提示：叶酸受体在无功能垂体腺瘤细胞中特异性高表达,而在正常垂体和其它类型中不表达。本课题旨在探讨：无功能垂体腺瘤细胞能否能通过叶酸受体靶向摄取这种硼携带剂,并探讨叶酸受体介导的硼中子俘获疗法对无功能垂体腺瘤细胞的治疗作用及可能机制。方法：原代培养的无功能垂体腺瘤细胞和叶酸受体靶向的含硼碳纳米颗粒孵育后,用免疫荧光方法检测无功能垂体腺瘤细胞的叶酸受体表达情况和摄取碳纳米颗粒的情况；用电感偶合等离子体发射光谱仪检测细胞中硼的浓度；用中子束照射照射摄取了硼携带剂的无功能垂体腺瘤细胞,然后检测细胞的活力和凋亡情况,并检测硼中子俘获治疗后无功能垂体腺瘤细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况。结果：叶酸受体靶向的含硼碳纳米颗粒能选择性地被表达叶酸受体的无功能垂体腺瘤细胞摄取,而无叶酸受体表达的其它类型垂体腺瘤细胞不能摄取这些碳纳米颗粒。叶酸受体介导的硼中子俘获疗法治疗后,无功能垂体腺瘤细胞的细胞活力显著下降,同时凋亡细胞显著增加。叶酸受体介导的硼中子俘获治疗能导致肿瘤细胞中Bcl-2的表达显著下降和Bax的表达显著提高。结论：叶酸受体靶向的含硼碳纳米颗粒能被无功能垂体腺瘤细胞靶向摄取,并可以在中子的照射下杀伤无功能垂体腺瘤细胞。我们的研究也为难治性无功能垂体腺瘤的治疗提供新的思路,同时拓展了硼中子俘获疗法的应用,尤其在良性肿瘤中的应用。