新生克隆猪不同组织中IGF2/H19基因和IGF2R基因的甲基化状态研究

论文摘要

猪体细胞克隆技术在畜牧业生产、医药研究、治疗性克隆和珍稀濒危动物的保护等方面具有重要的意义,然而克隆效率低及克隆动物发育异常等严重制约了该技术的发展和应用。供体细胞的不完全重编程是导致其效率低和发育异常的重要原因。印迹基因甲基化重编程是供体核重编程的重要内容,而且印迹基因的正常表达对克隆动物胚胎的生长和发育至关重要,其异常的DNA甲基化可以使其不表达或表达异常,从而促使克隆胚胎流产和出现发育异常等。因此检测新生死亡克隆猪内脏组织中与发育相关印迹基因的甲基化状态是十分必要、也是非常有意义的。通过体细胞克隆获得2头克隆枫泾猪,其中1头出生时死亡。为了探求新生克隆猪不同组织中印迹基因的甲基化状态以及是否存在印迹基因的不完全甲基化重编程。本研究运用亚硫酸氢盐测序法分别检测了IGF2/H19基因和IGF2R基因差异性甲基化区(DMR)在新生死亡克隆猪和同期正常繁殖猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中的甲基化状态,同时也检测了它们在与供体细胞同批的胎儿成纤维细胞中的甲基化状态,旨在探索核移植过程中印迹基因的甲基化重编程机制,为提高猪体细胞克隆效率提供理论依据。主要研究结果如下：(1) IGF2/H19基因DMR1和DMR3在克隆猪和正常猪心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏中甲基化状态不同,但差异不显著(P>0.05)；(2) IGF2/H19基因DMR2在克隆猪肺脏和肾脏中甲基化水平较高,尤其在肺脏中处于超甲基化状态,极显著高于正常猪(P<0.01),而在其它组织差异不显著(P>0.05)；(3) IGF2R基因DMR2在克隆猪肝脏中处于超甲基化状态,显著高于正常猪(P<0.05)；在肺脏中处于去甲基化状态,极显著低于正常对照猪(P<0.01)：在其它组织中,差异不显著(P>0.05)；(4) IGF2/H19基因DMR2在同批胎儿成纤维细胞中的甲基化水平与其在克隆猪心、肝、脾和肾组织中的甲基化水平差异不显著(P>0.05),但极显著低于其在克隆猪肺组织中的甲基化水平(55.60% vs 95.20%,P<0.01)；(5)IGF2R基因DMR2在同批胎儿成纤维细胞中的甲基化水平与其在克隆猪心、脾和肾组织中的甲基化水平差异不显著(P>0.05),但显著低于其在克隆猪肝组织中的甲基化水平(48.24% vs 80.00%,P<0.05)和极显著高于其在克隆猪肺组织的甲基化水平(48.24% vs 14.71%,P<0.01)结果显示,IGF2/H19基因DMR2在克隆猪肺脏中存在异常的DNA甲基化；IGF2R基因DMR2在克隆猪肝脏与肺脏中存在异常的DNA甲基化。结果说明印迹基因的甲基化状态在克隆猪不同组织中不同；供体核在核移植过程中存在不完全的DNA甲基化重编程。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 符号说明
• 1 文献综述
• 1.1 基因印迹研究进展
• 1.1.1 基因印迹的概念及其发现
• 1.1.2 印迹基因的基本特征
• 1.1.3 基因印迹的分子机制
• 1.2 猪体细胞克隆研究进展
• 1.2.1 体细胞核移植研究进展
• 1.2.2 猪体细胞克隆的主要环节及影响因素
• 1.2.3 猪体细胞克隆技术的应用价值
• 1.3 基因印迹与克隆动物发育
• 1.3.1 基因印迹与DNA甲基化
• 1.3.2 基因印迹与克隆动物发育异常
• 1.4 本试验拟研究印迹基因的研究现状
• 1.4.1 H19基因
• 1.4.2 IGF2基因
• 1.4.3 IGF2R基因
• 1.4.4 IGF2和H19基因印迹机制
• 1.5 本研究的目标和内容
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验试剂
• 2.1.4 部分试剂的配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 克隆猪的获得
• 2.2.2 组织样本的采集和保存
• 2.2.3 基因组DNA提取
• 2.2.4 基因组DNA浓度和质量的检测
• 2.2.5 硫酸氢钠修饰基因组DNA
• 2.2.6 巢氏PCR引物
• 2.2.7 PCR扩增
• 2.2.8 PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.9 目的片段纯化与回收及克隆测序
• 2.2.10 常用软件
• 3 结果与分析
• 3.1 各样品基因组DNA的提取
• 3.2 基因组DNA的紫外分光光度计检测结果与分析
• 3.3 巢氏PCR扩增结果与分析
• 3.4 目的片段克隆结果及分析
• 3.5 猪各组织中IGF2/H19和IGF2R基因的甲基化状态及分析
• 3.5.1 IGF2/H19基因DMR1的甲基化状态及分析
• 3.5.2 猪不同组织中IGF2/H19基因DMR2的甲基化分析
• 3.5.3 猪不同组织中IGF2/H19基因DMR3的甲基化分析
• 3.5.4 猪不同组织中IGF2R基因DMR甲基化分析
• 3.6 供体细胞IGF2/H19和IGF2R基因的甲基化状态及分析
• 4 讨论
• 4.1 印迹基因甲基化的研究方法
• 4.1.1 甲基化敏感的限制性内切酶法
• 4.1.2 甲基化特异性PCR（MSP）
• 4.1.3 亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing）
• 4.2 印迹基因在克隆猪各组织中的甲基化
• 4.3 印迹基因在同批传代胎儿成纤维中的甲基化
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢