论文摘要
肺支原体、溶神经支原体和关节炎支原体是啮齿类实验动物的主要致病菌，也是清洁级实验动物必须排除的病原微生物。我国实验动物支原体感染的实验室检测方法以分离培养和检测血清抗体为主，前者操作繁琐、结果受到操作者技术水平的影响，并且检测所需时间长；后者为间接判断动物的感染、不适用于某些免疫缺陷或免疫修饰而导致产生抗体障碍的动物的检测。为此，本研究通过制备抗实验啮齿类动物支原体单克隆抗体，进而建立以检测支原体抗原为对象的双抗体夹心ELISA方法，旨在能够快速、敏感、直接判断动物感染。首先，肺支原体mAb的制备与鉴定。肺支原体抗原谱较广，以19612全菌蛋白为免疫原，3种啮齿类动物易感支原体全蛋白为筛选抗原，制备出9种单抗细胞株，与先前的猪鼻单抗、三种支原体共同抗原的单抗进行了系统的鉴定，包括亚类鉴定、相对分子质量、特异性及敏感性等。其次，选择最佳配对抗体，建立双抗夹心ELISA法。我们将不同来源的单抗进行配对组合，最终选择12A9作为捕获抗体，酶标E5作为检测抗体用作双抗体夹心ELISA的检测试剂，对啮齿类实验动物易感的三种支原体模式菌株的检测灵敏度达到ng级水平，诊断特异性和敏感性均较好。最后，该双抗体夹心ELISA法应用于实际检测。在对120只感染动物的实际检测中，双抗体夹心ELISA的阳性检出率较高，与分离培养的检测结果一致性分别为92.6％(M53)、91.7％(19611)、95.2％(19612)、92.9％(19988)。本研究为将来实验动物支原体抗原的实际检测打下了基础，为其他实验动物微生物监测方法的改良提供了实验依据。支原体是一类缺乏细胞壁的原核微生物，能引起鼠呼吸系统支原体病(MRM)和鼠生殖系统支原体病(MGM)，其膜蛋白是支原体最重要的表面抗原物质。除无胆甾原体外，目前用于支原体的培养基大都含动物血清，以此为其生长繁殖提供脂质前体，而脂类成分的抗原是支原体的主要抗原。由于不同动物的血清成份存在差异，故其所培养的支原体的抗原性可能亦有差异。为此，我们将肺支原体用含马血清和猪血清的培养基培养，观察不同的血清环境和传代次数对肺支原体致病性和抗原性的影响。在致病性研究中，我们利用肺支原体模式菌株19612和M53感染实验动物，结果19612感染实验大鼠、小鼠均失败，后通过感染实验鼠离体气管粘膜细胞，发现经多次传代的肺支原体模式株19612失去黏附性，无法黏附到动物气管粘膜细胞上，丧失致病性。在抗原性研究中，免疫印迹结果提示：一，用不同培养基培养的同一株肺支原体，相对分子质量33×10~3处的蛋白表达量不同；二，相对分子质量33×10~3处的蛋白也是血清中的抗原成分；三，不同肺支原体株之间的抗原条带存在差异。本研究考察了与肺原体致病性和抗原性有关的一些因素，这些为今后诊断试剂的研制提供了参考，具有重要意义。