红豆杉及菊科植物中萜类单体化合物抗肺癌活性筛选及其作用机制研究

论文摘要

第一部分萜类化合物抗肺癌活性筛选萜类化合物紫杉醇（Taxol?）是美国学者Dr. Wall最早于1971年从太平洋红豆杉（Taxus brevifolia）的树皮中分离得到的萜类抗肿瘤活性成分,1992年美国FDA批准了紫杉醇用于卵巢癌的治疗,1994年又批准其用于乳腺癌的治疗,此后,紫杉醇很快应用于多种常见恶性肿瘤,并取得了显著的疗效,成为抗癌的主要明星药物,引起了肿瘤界的极大关注和期望。但是,紫杉醇取自红豆杉的树皮,红豆杉全世界仅有11种,分布范围狭窄,生长极为缓慢,加上紫杉醇在树皮中的含量很低,这就大大地限制了紫杉醇的开发利用。为此,本实验对多种植物来源的萜类化合物进行了抗肺癌活性筛选,目的是寻找有效的植物来源抗癌成分,以缓解紫杉醇对环境资源的破坏以及紫杉醇来源受限的局面。目的:为了缓解紫杉醇供不应求的局面,寻找到活性更强毒性更小的化合物,本研究对东北红豆杉和加拿大红豆杉可再生针叶中提取纯化得到的16种非紫杉醇二萜类化合物为对象,对人肺肿瘤细胞增殖抑制活性进行了筛选,并进行了肿瘤细胞增殖抑制活性和结构之间构-效关系的探讨。同时为了扩大药源,筛查更多的有效抗癌成分,本研究还对来自菊科植物中的18种倍半萜类化合物进行了抗肺癌肿瘤细胞的活性筛选。方法:应用MTT比色法进行活性筛选。细胞接种于96孔板,每孔含1×104个细胞,分别加入溶剂对照（终浓度0.1% DMSO）、阳性对照顺铂和各种实验用化合物,终浓度为100μmol/L、10μmol/L和1μmol/L,每组设3复孔,置于饱和湿度、37℃和5% CO2培养箱中培养48 h。于培养结束前4 h,各培养孔加入5 mg/mL MTT 10μL。实验终止测定各孔吸光度值（OD值）,测定波长λ= 570 nm,参考波长λ= 630 nm,并计算细胞增殖抑制率或存活率。细胞增殖抑制率（%）=（1-给药组OD值/对照组OD值）×100;细胞存活率（%）=（给药组OD值/对照组OD值）×100;实验用化合物对肿瘤细胞的浓度-效应曲线用Hill数学模型拟合,计算实验用化合物的半数抑制浓度（IC50）值。结果:34种萜类化合物抑制人肺肿瘤细胞的增殖活性的筛选结果为:二萜类化合物taxinine （3）对实验用五种人肺肿瘤细胞的增殖均有较强的抑制活性,其中对A549细胞的增殖抑制率在浓度为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L时分别为23.81 %,60.40 %和90.18 %;2α,10β-diacetyl-5- cinnamoyl-phototaxicin II （12）和taxuspine A （16）除对RERF-LC-KJ细胞外的四种人肺肿瘤细胞的增殖均有较强的抑制活性,其中化合物12对A549细胞的增殖抑制率在浓度为1μmol/L、10μmol/L和100μmol/L时分别为18.31%,48.73%和68.19%;化合物16对A549细胞的增殖显示较强的抑制活性,半数抑制浓度（IC50）为9.54μmol/L。倍半萜内酯类化合物17 （异土木香内酯）、22 （泽兰内酯）、23 （3β,9β-diacetoxy- 1β,10α-epoxy-11α,13- dihydrocostunolide）、29 （achillinin A）和30 （dehydrocostuslactone）对三种人非小细胞肺肿瘤细胞的增殖均显示较强的抑制活性,化合物32 （dihydrodehydro-costuslactone）对QG-56细胞的增殖抑制率为90.75%;化合物22、23、29和30对人小细胞肺癌PC-6细胞的增殖均显示较强的抑制活性,化合物17、22、23、29和30对人小细胞肺癌QG-90细胞的增殖显示较强的抑制活性。小结:从东北红豆杉和加拿大红豆杉中提取的3种二萜类化合物和从菊科植物中提取的5种倍半萜类化合物对人肺肿瘤细胞具有较强的增殖抑制活性;人肺肿瘤细胞的增殖抑制活性不仅与紫杉烷类化合物的骨架结构密切关系,而且该类化合物的抑制人肺肿瘤细胞增殖活性可能还与C-5位具有的肉桂酰基侧链密切相关。第二部分异土木香内酯体内外抗癌活性及构-效关系研究菊科植物在我国资源丰富,富含倍半萜类化学成分,其结构类型多,具有多种生物活性。土木香（Inula helenium）系菊科旋覆花属植物,为多年生草本,从土木香中提取的单体化合物异土木香内酯,具有抗结核、抗炎和抗肿瘤的效果。目的:为较系统地研究异土木香内酯的抗肿瘤活性,并探讨异土木香内酯抗瘤活性与结构的关系,本实验室采用体外培养的人小细胞肺肿瘤细胞株和人非小细胞肺肿瘤细胞株以及人多种其他器官由来的肿瘤细胞株对从土木香的根中纯化的六种倍半萜内酯化合物进行了体外增殖抑制实验。为探讨其对正常细胞的毒性作用,应用MTT法对正常仓鼠肺成纤维细胞（CHL）抗增殖活性进行观察,并构造裸鼠人肺癌A549移植性肿瘤模型,观察异土木香内酯体内抗瘤活性及对体重和免疫器官脾的影响。方法:采用MTT比色法观察异土木香内酯对人多器官由来的肿瘤细胞及CHL的增殖抑制活性,具体方法与第一部分相同。利用人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤动物模型,检测异土木香内酯体内抗人肺癌的效果。选取6-8周龄,体重18-22 g之间雌性裸鼠,接种人肺腺癌细胞A549于裸鼠右前腋下,1周后肿瘤平均达6×6 mm,随机分为5组,每组6只。空白对照组:按照0.1 mL /10 g体重腹腔注射生理盐水。阳性对照组:给予顺铂干预,2 mg/ kg体重给药,连续腹腔注射7天。实验组为异土木香内酯,灌胃给药,分为实验低剂量组:1 mg/ kg体重给药;实验中剂量组:10 mg/kg体重给药;实验高剂量组:100 mg/ kg体重给药;连续给药10天。于给药后12天脱颈处死裸鼠,迅速剥离瘤块及脾脏,称重记录。按照公式:肿瘤抑瘤率=（1-给药组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）×100%,计算药物抑瘤率。按照公式:脾指数=平均脾重/平均体重×1000,计算脾指数。结果:异土木香内酯作用于人肺癌细胞株,具有较强的抗细胞增殖作用,对人非小细胞肺癌细胞A549和QG-56增殖的半数抑制浓度（IC50）分别为3.01μmol/L和9.39μmol/L,对人小细胞肺肿瘤细胞（PC-6和QG-90）的增殖抑制作用与阳性对照顺铂相同,与空白对照组比较有显著差异（p<0.05）。异土木香内酯对人脑神经胶质瘤细胞U251SP细胞增殖的IC50为10.55μmol/L,对人肝癌细胞株HLE和人黑色素瘤细胞株MM1-CB细胞的增殖均显示明显抑制作用,化合物2-Hydroxy-11,13- dihydroxy-isoala ntolactone （20）、11α,13-Dihydroxyisoal anto-lactone（21）、2α-hydroxy- 11α,13-dihydroisoalantolactone（25）、britannila ctone（27）和1-O-acetylbritanni lactone（28）对本实验用细胞的增殖不显示抑制活性,IC50均大于100μmol/L。用100μmol/L异土木香内酯处理CHL细胞,对其增殖的抑制率为46.33%,异土木香内酯对CHL的IC50大于100μmol/L。体内抗人肺癌裸鼠模型实验,于实验结束后处死裸鼠剥取瘤重,称取体重。空白对照组平均体重27.5 g,平均瘤重0.53 g;阳性对照顺铂组平均体重为26.5 g,平均瘤重0.42 g;异土木香内酯高剂量组（100 mg/kg）、中剂量组（10 mg/kg）、低剂量组（1 mg/kg）平均体重分别为26.6 g、27.0 g和27.2 g;平均瘤重分别为0.38 g、0.44 g和0.47 g。抑瘤率分别为:顺铂组20.8%,实验药物高剂量组为28.3%,中剂量组为17%,低剂量组为11.4%。各组的裸鼠模型脾指数分别为:空白对照组5.81,顺铂组3.37,异土木香内酯高剂量组5.19,中剂量组6.51,低剂量组5.12。小结:异土木香内酯具有明显的抗多种恶性肿瘤细胞增殖活性,并具有浓度依赖性;异土木香内酯具有明显的体内抗瘤活性,一定浓度下其抑瘤效果优于顺铂,并对体重和脾脏没有明显的损伤作用;异土木香内酯对仓鼠肺成纤维细胞的增殖抑制作用低于顺铂;异土木香内酯活性与其具有的α,β-不饱和五员内酯环的结构有关,不饱和的环外双键氢化饱和后形成饱和五员内酯环,可能是抗肿瘤活性消失或减弱的原因,A-环开环可能是导致其体外抑制肿瘤细胞增殖作用消失或减弱的另一原因。第三部分异土木香内酯抗肺癌作用机制研究离体和在体实验均已证明,许多抗癌药物均可对不同类型的敏感瘤细胞诱导凋亡,临床上应用的放疗、热疗以及一些生物治疗的目的也主要是引发细胞凋亡。中国传统药物中最近发现很多成分具有抗瘤作用,并且报道发现,这些成分多通过诱导细胞凋亡而发挥作用。基于此,本实验对异土木香内酯的抗瘤活性机制进行了研究。目的:在发现异土木香内酯对肺癌细胞具有明显抗增殖活性的基础上,首先对其是否引起肺癌细胞凋亡进行了研究,并对其作用于肿瘤细胞引起的细胞因子变化进行了探讨,以明确异土木香内酯的抗肺癌活性机制。方法:1.吖啶橙（acridine orange, AO）染色观察凋亡形态变化。用终浓度为10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L异土木香内酯处理A549细胞,48 h后弃去培养液,滴加吖啶橙工作染液染色,荧光显微镜下用紫蓝光激发滤片,观察,拍照。2.流式细胞术（flow cytometry, FCM）观察异土木香内酯作用A549细胞后凋亡情况和细胞周期变化。用直径100 mm的培养皿培养A549细胞,1×106个,三枚加入异土木香内酯,终浓度为20μmol/L、40μmol/L和80μmol/L,一枚为对照组。继续培养24 h后,胰酶消化后收集细胞,加入10%鸡红细胞作为内参标准,与样品同步染色,加入碘化丙啶一步插入DNA荧光染色,以500目铜网过滤,采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪进行DNA检测。3. DNA Ladder技术观察凋亡DNA片段。用直径60 mm的培养皿培养A549细胞,3×105个,一枚为对照组,三枚加入异土木香内酯,终浓度为5μmol/L、10μmol/L和20μmol/L。继续培养48 h后,收集全细胞,细胞裂解液裂解细胞后用酚氯仿法提取DNA,1%琼脂糖凝胶电泳,50V,2 h。DNR MiniBIS Pro照相系统拍照。4. Western Blotting技术观察异土木香内酯作用肺癌细胞后7种蛋白因子Caspase-3、Bax、Bcl-2、HSP、Akt、P53及P21变化。用直径100 mm的培养皿培养A549细胞,1×106个,一枚为对照组,一枚加入顺铂,终浓度为20μmol/L,四枚加入异土木香内酯,终浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L。化合物作用人肺癌细胞48 h后,收集全细胞。裂解细胞后,聚丙烯凝胶电泳,牛奶封闭,转膜,依次与一抗和二抗孵育,化学发光,显影。5.利用MTT法,检测了半胱天冬酶抑制剂对异土木香内酯抑制人肺癌细胞增殖的翻转作用。使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的异土木香内酯处理A549细胞,加入20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与土木香内酯共同孵育48 h后,MTT法测定OD值。结果:1.吖啶橙染色显示,经异土木香内酯作用后的A549细胞,细胞数目减少,核染色质浓缩,细胞膜皱缩,并形成凋亡小体。2.经异土木香内酯处理A549细胞后,与对照组相比,凋亡峰随浓度升高而逐渐增加,异土木香内酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L浓度时凋亡细胞比率分别为0.85%、0.82%、6.59%和15.32%。细胞周期分析显示,随异土木香内酯浓度升高,G1期细胞数随之升高,其他各期细胞数随之降低,异土木香内酯在0μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L浓度时处于G1期细胞比率分别为33.4%、37.7%、57.3%和60.2%。3.异土木香内酯处理A549细胞后48 h,琼脂糖电泳发现浓度在10μmol/L和20μmol/L时出现DNA梯状条带,并呈浓度依赖性。4.异土木香内酯在浓度为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L和40μmol/L时处理A549细胞,48 h后Akt、HSP90α无明显变化,Caspase-3、Bax、P53和P21随药物浓度增加而增加,Bcl-2则随浓度降低,其中p53和p21具有时间依赖性,p53和p21在异土木香内酯内酯作用于A549细胞后12 h、24 h、48 h逐渐升高。5.使用1μmol/L、10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L的异土木香内酯处理A549细胞,其细胞生存率分别为81.01%、31.03%、22.00%和13.96%,使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂与土木香内酯共同孵育A549细胞后,其细胞生存率分别上升为93.34%、68.76%、74.80%和70.14%,且20μmol/L的半胱天冬酶抑制剂可显著翻转异土木香内酯对A549细胞增殖的抑制作用。小结:1异土木香内酯通过诱导人肺腺癌A549细胞凋亡而发挥抗瘤活性,并使细胞停滞在G1期。2异土木香内酯通过p53通路发挥抗人肺腺癌A549活性,使p53增高,顺次促使p21升高,作用于Cdk,使细胞停滞在G1期;p53促进Bax增高,Bcl-2抑制,进一步引起Caspase-3增高,引起细胞凋亡。各蛋白因子的变化都具有浓度依赖性,p53和p21具有时间依赖性。3异土木香内酯对人肺腺癌A549抗瘤活性机制与紫杉醇不同,紫杉醇使A549细胞停滞在M期。4异土木香内酯抗人肺腺癌A549机制与PI3K/Akt通路无关,与HSP90α无关。结论:1三种二萜类化合物及五种倍半萜类化合物对人肺肿瘤细胞的增殖有较强的抑制活性,其活性与结构有一定关系。2异土木香内酯具有明显的体内抗瘤活性,对正常细胞无明显毒性。3异土木香内酯抗瘤机制与紫杉醇不同,通过p53通路发挥抗人肺腺癌A549活性,使p53增高,进而促使p21升高,使细胞停滞在G1期;p53促进Bax增高,Bcl-2抑制,进一步引起Caspase-3增高,诱导细胞凋亡。各蛋白因子的变化都具有浓度依赖性,p53和p21具有时间依赖性。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 引言
• 第一部分 天然二萜类和倍半萜类化合物体外抗人肺癌活性筛选 及其构效关系探讨
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 异土木香内酯体内外抗癌活性及构-效关系研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第三部分 异土木香内酯抗肺癌作用机制研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 结论
• 综述一 Cancer-fighting Molecules-Taxol and Its Analogues
• REFERENCES
• 附表
• 致谢
• 个人简历