新型融合抗菌肽基因重组真核质粒的构建及抗菌活性研究

论文摘要

抗菌肽（antibacterical peptides，ABP）是指存在于生物体内具有抵抗外界微生物侵害，消除体内突变细胞的一类由生物细胞特定基因编码产生的小分子多肽，又称为微生物肽（antimicrobial peptide，AMP）或肽抗生素（peptide antibiotics）（Boman HG，1991）。抗菌肽具有分子量小、对热稳定、抗菌谱广、只作用于原核细胞而对真核细胞无害的特点，在当前抗生素的耐药性较为普遍，开发一种新的抗生素又极其困难的情况下，倍受人们青睐。根据已知抗菌肽的结构与功能的研究，进行新的抗菌肽的设计与改造，寻求一些具有抗肿瘤细胞和病毒、真菌、高效抗细菌的新型抗菌肽，为新药开发提供了新途径。本实验应用PCR扩增技术，将已连入原核载体pGEX-4T-1的ECD抗菌肽融合基因亚克隆至真核分泌型表达载体VR1020中，构建了VR1020-ECD（VR-ECD）真核表达质粒，经菌落PCR初步筛选，BamHⅠ／BglⅡ双酶切及质粒PCR鉴定筛选出正确重组真核质粒VR-ECD；测序结果比对显示，ECD融合基因片段已正确亚克隆至真核表达载体VR1020上，为进一步研究其生物活性奠定了可靠的基础。进一步提取高纯度VR-ECD重组真核表达载体质粒，以真核表达载体VR1020为对照，经JetPEITM Cationic polymer介导转染真核HEK293细胞。同时，本实验运用离子交联法制备了壳聚糖纳米颗粒（chitosan nanoparticles，CNP），探索了CNP包裹高纯度VR-ECD重组真核表达载体质粒（CNP-VR-ECD）介导DNA在体外小剂量转染哺乳动物细胞的效果。分别在转染后24h、48h、72h提取转染细胞总RNA进行RT-PCR检测，并取转染细胞培养上清对标准大肠杆菌、肠产毒性大肠杆菌，绿脓杆菌，金黄色葡萄球菌和肺炎球菌进行抑菌活性检测，用氨苄青霉素和卡那霉素作阳性抗菌对照。结果显示，转染后HEK293细胞的总RNA中均含有与目的DNA片段相对应的mRNA，且上清液对上述五种标准菌株的生长均有较明显的抑制作用（P＜0.05）。表明重组真核质粒成功转染HEK293细胞并分泌表达出具有较强抗菌活性的新型ECD融合抗菌肽。这些结果为进一步研究ECD融合抗菌肽在生物体内的抗菌活性及研制新型动物抗菌制剂奠定了可靠的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 ECD抗菌肽融合基因重组真核质粒的构建
• 1. 引言
• 2. 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒和宿主菌
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 抗菌肽融合基因片段的制备
• 2.2.2 载体片段的制备
• 2.2.3 抗菌肽融合基因目标片段克隆到VR1020载体中
• 2.2.4 连接产物的转化
• 2.2.5 重组质粒的筛选和鉴定
• 2.2.6 重组质粒中插入片段的序列测定及结果分析
• 3 结果
• 3.1 抗菌肽融合基因片段的制备
• 3.2 载体片段的制备
• 3.3 重组真核表达质粒的构建
• 4 讨论
• 第二部分 ECD抗菌肽融合蛋白基因抗菌活性研究
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 转染用细胞和质粒
• 2.1.2 实验用菌株
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基及溶液的配置
• 2.2 方法
• 2.2.1 转染用质粒DNA的制备
• 2.2.2 壳聚糖包裹质粒DNA纳米颗粒的制备
• 2.2.3 转染用HEK293细胞的准备
• 2.2.4 重组真核表达质粒转染HEK293细胞
• 2.2.5 抗菌肽融合基因在真核细胞中表达的检测
• 3 结果
• 3.1 壳聚糖纳米颗粒的形态、粒径及zeta电位
• 3.2 凝胶阻滞分析
• 3.3 RT-PCR的结果
• 3.4 转染细胞上清液抑菌活性检测
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 抗菌肽研究进展
• 1 引言
• 2 抗菌肽的来源
• 2.1 昆虫抗菌肽
• 2.2 两栖类抗菌肽
• 2.3 鱼类抗菌肽
• 2.4 哺乳动物抗菌肽
• 2.5 植物抗菌肽
• 2.6 细菌抗菌肽
• 2.7 病毒抗菌肽
• 2.8 禽类抗菌肽
• 3 抗菌肽的结构特点和生物学活性
• 3.1 抗菌肽的结构特点
• 3.2 抗菌肽的生物学活性
• 3.2.1 抗菌肽对细菌的杀伤作用
• 3.2.2 抗菌肽对真菌的杀伤作用
• 3.2.3 抗菌肽对寄生虫的杀伤作用
• 3.2.4 抗菌肽对癌细胞的杀伤作用
• 3.2.5 抗菌肽对性传播病原体的杀伤作用
• 3.2.6 抗菌肽的免疫调节作用
• 4 抗菌肽的分子生物学和基因表达的调控
• 5 抗菌肽抗菌机理研究进展
• 5.1 膜结合型抗菌肽抗菌机理
• 5.2 非膜结合型抗菌肽抗菌机理
• 5.2.1 抑制蛋白质及细胞壁合成
• 5.2.2 线粒体攻击作用
• 5.2.3 对细胞核染色体的影响
• 5.2.4 对癌细胞骨架的断裂作用
• 5.3 协同抗菌作用和其它生物学功能
• 6 抗菌肽的开发应用
• 6.1 抗菌肽的分子设计和合成
• 6.1.1 α-螺旋结构新型抗菌肽的分子设计
• 6.1.2 嵌合体肽的设计合成
• 6.1.3 通过化学合成抗菌肽来阐明其生物合成途径
• 6.2 抗菌肽的生产
• 7 抗菌肽的应用
• 7.1 在农业、畜牧业上的应用
• 7.2 抗菌肽在医药研制上的应用
• 7.3 抗菌肽在抗菌、抗病毒药物研制上的应用
• 7.4 抗菌肽在治疗癌症上的应用
• 7.5 抗菌肽的抗寄生虫作用
• 7.6 抗菌肽在中医药上的应用
• 7.7 食品工业应用
• 8 存在的问题及解决方案
• 9 结语
• 参考文献
• 在读硕士阶段发表论文情况
• 致谢