嗜酸氧化亚铁硫杆菌周质蛋白的选择性分离及双向电泳差异谱的建立

论文摘要

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（A.ferrooxidans）是一种化能自养嗜酸性革兰氏阴性细菌,可以通过氧化亚铁离子与硫单质或含硫化合物获得能量生长。A.ferrooxidans是目前使用最广泛,研究最深入的浸矿微生物。A.ferrooxidans对能源基质的氧化利用主要发生在细胞周质空间内,但由于对A.ferrooxidans单质硫氧化过程的相关研究相对缺乏,目前还并不确定氧化元素硫的蛋白作用机制,对其周质空间的研究能大大简化研究步骤提高效率。本论文以蛋白总量和苹果酸脱氢酶活性为两个重要指标,对比了已有周质蛋白提取方案的提取效率和胞质蛋白污染情况,最终确定渗透休克法为提取A.ferrooxidans周质蛋白最适合方法,并以胞质蛋白污染尽可能少为原则,针对A.ferrooxidans ATCC 23270周质蛋白提取对渗透休克法的渗透液作用时间,高渗液与低渗液的摩尔比例以及渗透液总体积进行了适当优化并对优化结果进行了验证。优化结果为:对于0.1克（湿重）细胞,渗透液的作用时间为15 min,高渗液与低渗液的摩尔比为1:1,渗透液的总体积为10 mL。研究了双向电泳上样量,等电聚焦电压以及SDS-PAGE电流,确定了适合于A.ferrooxidans周质蛋白的双向电泳条件为:双向电泳的上样量300μg,等电聚焦电压设定为30 V,12 h;500 V,5 h;1000V,1 h;3000 V,30 min;5000 V,30 min;7000 V,1 h;8000 V,6 h。第二向电流为单片凝胶电泳时电流设定为10 mA,60 min;25 mA,7h。利用优化的渗透休克法对单质硫培养基下不同生长时期的A.ferrooxidans抽提周质蛋白后进行双向电泳,得到电泳图谱后进行初步对比分析发现:对数期和稳定期的周质蛋白多为分子量较小的碱性蛋白,稳定期中有些蛋白斑点消失,但也出现了一些分子量相对较大的蛋白斑点;衰亡期中,由于细胞凋亡,细胞周质蛋白提取液中明显包含胞质蛋白,双向电泳谱中蛋白斑点也明显增多。这些结果为进一步研究周质空间内功能性蛋白奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩写词简表
• 第一章 绪论
• 1.1 生物技术在资源加工提取中的工业应用现状
• 1.2 氧化亚铁硫杆菌的生物学特征
• 1.2.1 A.ferrooxidans形态特征
• 1.2.2 生存条件
• 1.2.3 生理生化特征
• 1.3 A.ferrooxidans的分离纯化
• 1.4 A.ferrooxidans亚铁氧化系统的研究进展
• 1.4.1 顺电势梯度电子传递载体
• 1.4.2 逆电势梯度电子传递载体
• 1.5 A.ferrooxidans硫氧化系统研究进展
• 1.5.1.金属硫化物的溶解
• 1.5.2 单质S的氧化
• 3^2-的氧化'>1.5.3 SO₃^2-的氧化
• 2O₃^2-的氧化'>1.5.4 S₂O₃^2-的氧化
• 1.5.5 硫氧化系统的可能模式
• 1.6 革兰氏阴性菌的表层结构
• 1.6.1 革兰氏细菌的分类及原理
• 1.6.2 革兰氏阴性菌的细胞壁构成
• 1.6.3 革兰氏阴性菌的细胞外被
• 1.7 周质蛋白提取方案的研究
• 1.7.1 周质蛋白的概念
• 1.7.2 周质蛋白的提取
• 1.7.3 胞外多聚物的去除
• 1.8 双向电泳方法的研究进展
• 1.8.1 双向电泳基本原理
• 1.8.2 双向电泳的基本操作步骤
• 1.9 课题研究的意义及主要内容
• 1.9.1 本研究的目的和意义
• 1.9.2 本论文研究内容
• 1.9.3 课题受资助情况
• 第二章 A.ferrooxidans周质蛋白提取方案的确定
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌种
• 2.2.2 培养基
• 2.2.3 实验试剂与大型仪器
• 2.3 菌体培养与收集
• 2.4 菌体收集与预处理
• 2.5 A.ferrooxidans周质蛋白的提取方案
• 2.6 周质蛋白提取方案的确定标准
• 2.6.1 提取液中蛋白量的确定
• 2.6.2 提取液中胞质蛋白污染的确定
• 2.7 A.ferrooxidans周质蛋白的提取方案筛选确定
• 2.8 渗透休克法处理后的A.ferrooxidans细胞透射电镜照片
• 2.9 本章小结
• 第三章 渗透休克法提取A.ferrooxidans周质蛋白的优化
• 3.1 引言
• 3.2 试验试剂与大型仪器
• 3.3 渗透休克法的优化
• 3.4 改良渗透休克法与原始渗透休克法提取A.ferrooxidans周质蛋白SDS-PAGE对比图
• 3.4.1 SDS-PAGE实验操作程序
• 3.4.2 改良渗透休克法与原始渗透休克法提取A.ferrooxidans周质蛋白SDS-PAGE对比图
• 3.5 本章小结
• 第四章 不同生长时期的A.ferrooxidans周质蛋白双向电泳图谱对比
• 4.1 引言
• 4.2 实验试剂与大型仪器
• 4.3 细菌周质蛋白的提取与双向电泳样品制备
• 4.4 双向电泳具体操作步骤
• 4.5 双向电泳的条件摸索
• 4.6 不同生长时期A.ferrooxidans细菌周质蛋白双向电泳谱对比分析
• 4.7 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 参考文献
• 致谢
• 研究成果