论文摘要
目的 研究缺氧诱导因子-1α(（hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α）基因转染人间充质干细胞（human mesenchymal stem cells,hMSCs）的体内促血管生成作用,为促进组织工程骨血管化提供新的方法和策略。 方法 1.HIF-1α基因转染人间充质干细胞:将构建的pIRES3/HIF-1α逆转录病毒载体转染PT67包装细胞,制备含目的基因的重组逆转录病毒液,感染hMSCs,获得稳定高表达HIF-1α的hMSCs。用RT-PCR法检测转基因hMSCs表达HIF-1α的水平,用免疫组化法检测转基因hMSCs在缺氧和常氧条件下HIF-1α蛋白的存在情况。 2.转基因hMSCs体内促血管生成的研究:将转基因hMSCs和未转基因的hMSCs分别接种到13d的鸡胚绒毛尿囊膜（chicken chorioallantoic membrane,CAM）,3d后在解剖显微镜下原位观察并拍摄血管,然后将CAM用Bouin’s液固定,制片,在显微镜下观察并摄像。用Image-Pro Plus 4.5测量并分析血管面积。 结果 1.感染后的hMSCs经G418筛选后逐渐形成克隆,克隆中的hMSCs均表达EGFP,在倒置荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光。 2.缺氧条件下,转基因hMSCs中HIF-1α mRNA表达较未转基因的hMSCs明显增高。 3.免疫组化法检测HIF-1α蛋白结果显示:缺氧组转基因hMSCs细胞核内呈棕黄色,染色结果为阳性;常氧组转基因hMSCs细胞核未着色,染色结果为阴性。 4.CAM原位观察:对照组CAM细胞团周围血管走行稍曲折,血管生成不明显;实验组CAM细胞团周围出现大量新生血管,以细胞团为中心呈放射状排列。 5.CAM标本显微镜下观察:实验组CAM可见大量新生血管以细胞团为中心呈放射状排列形成辐条轮状。此外,细胞团内部可见密集的新生血管网。对照组细胞团周围无明显血管生成。试验组CAM血管密度较对照组明显增高。 6.图像分析结果显示实验组CAM较对照组CAM血管面积明显增多,有显著的统
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