光棘球海胆MYP基因非编码区序列及其SNPs分析

论文摘要

海胆的主要卵黄蛋白,因大量存在于海胆卵中而曾一度被归为卵黄蛋白原。但不同于其它物种的雌性特有,MYP同时存在于海胆精巢和卵巢中,为配子发生及胚胎发育提供营养。比对发现,其cDNA序列与其他物种卵黄蛋白原并无明显相似性,而与铁传递蛋白具有更高的相似性。据其存在场所和合成时期的差异,MYP可分为为CFMYP和EGMYP,二者均由同一基因编码。因其特殊性,国内外相关研究很多,并仍在持续进行。光棘球海胆不仅是我国重要的增养殖品种之一,且在发育生物学、遗传学、分子生物学等学科均有很好的科研价值。本实验选用光棘球海胆,对其主要卵黄蛋白MYP基因区域进行相关研究,旨在为MYP的下一步研究奠定基础。利用基因组步移方法,获得了MYP基因上下游未知序列,并通过常规PCR及克隆测序等获得基因组9个内含子的序列。在研究过程中,利用生物信息学对MYP上下游序列进行顺式作用元件分析。并选用基因下游,及内含子20的核苷酸序列进行SNPs检测。现将实验结果总结如下:1、经3次步移及克隆测序,获得MYP基因上游1782bp,应用生物信息学预测了其启动子,得到两条启动子序列P1和P2,P1起始于-96bp,P2起始于-565bp,两条序列均为50bp。在P1、P2序列中分别包含有GC box,GAGA box和CAAT box。推测MYP基因的两条启动子序列,在胚胎发育的不同时期分别对母源性卵黄蛋白（EGMYP）和体腔卵黄蛋白（CFMYP）的表达具有不同的调控作用。利用Tfsitescan软件,在MYP基因上游区域发现含有多种顺式作用元件,如:AP1-TRE0/C、NREBox1CS、IRF-E、ASK-MP4等。这说明MYP的表达调控方式复杂,受多条信号通路的共同调节。2、经2次基因组步移和一次常规PCR,获得了MYP基因下游共1182bp的序列。经Clustalx比对处理,得有效长度821bp。认为所得到的区域为光棘球海胆MYP编码前体mRNA的DNA序列,可被识别并转录形成前体mRNA,但在前体mRNA的后期剪接过程中被除去,并不参与后期功能蛋白的合成。经鉴定,在所获得的MYP下游区域序列中,存在两种信号元件,效率元件（EE）ATATAT（59bp-64bp）,和定位元件（PE）TTTTTTTT（347bp-354bp）。这些元件可能在MYP mRNA的后期剪辑、折叠、以及相关反式作用因子的识别与定位中起一定作用。3、MYP下游区域序列中,存在一些SNP突变位点,如622位存在A—G转换,648位存在T缺失等。这些突变可能影响到后期mRNA的修饰,而导致功能蛋白质的差异。4、获得MYP基因内含子5、6、11、14、15、16、17、18、及20的全部序列,总长5036 bp。经网上进行Blast发现,该九段序列均为新发现的未知序列。对部分内含子进行SNP检测,得内含子20的189位存在A—C突变,这些突变可能影响到前体mRNA的处理与修饰,从而在蛋白质水平造成差异。以上将为进一步研究MYP基因的表达调控和全基因的SNPS筛选奠定基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 前言
• 1 海胆概述及研究背景
• 1.1 海胆的生物学地位及研究意义
• 1.2 光棘球海胆的研究进展
• 1.3 海胆基因组计划
• 2 海胆MYP的研究进展
• 2.1 海胆MYP的概念及分类
• 2.2 海胆MYP与其他物种卵黄蛋白（原）比较
• 2.2.1 发生比较
• 2.2.2 结构及分子量比较
• 2.2.3 功能比较
• 2.3 海胆MYP研究进展及前景
• 3 基因侧翼序列的获得
• 3.1 质粒拯救（plasmid rescue）法
• 3.2 反向PCR（inverse or inverted PCR,IPCR）法
• 3.3 PCR-walking
• 3.4 连接介导PCR（Ligation-mediated PCR,LMPCR）
• 3.5 热不对称交错PCR（TAIL-PCR）
• 4 SNP标记的兴起和应用
• 4.1 分子标记
• 4.2 分子标记的种类及应用
• 4.3 单核苷酸多态性（SNPs）
• 4.3.1 SNPs的优势和特点
• 4.3.2 SNPs的分析方法
• 4.3.3 SNPs的检测方法
• 参考文献
• 第二章 海胆MYP基因侧翼序列的获得及分析
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 仪器设备
• 1.3 实验试剂及配制
• 2 方法
• 2.1 海胆总DNA的纯化提取
• 2.1.1 实验之前的准备
• 2.1.2 实验操作步骤
• 2.2 MYP基因上游区域引物设计
• 2.3 MYP基因下游区域引物设计
• 2.4 Genome Walking
• 2.4.1 实验原理
• 2.4.2 特异性引物设计原则
• 2.4.3 实验步骤
• 2.4.4 实验流程简图
• 2.5 PCR产物的克隆测序
• 2.5.1 PCR产物的纯化回收
• 2.5.2 大肠杆菌感受态细胞的制备
• 2.5.3 纯化产物与质粒载体的连接反应
• 2.5.4 感受态细胞的转化
• 2.5.5 转化子的筛选与鉴定
• 2.5.6 阳性克隆测序及分析
• 3 结果与分析
• 3.1 MYP基因上游启动子区域序列
• 3.1.1 测序结果
• 3.1.2 结果分析
• 3.1.2.1 同源性比对
• 3.1.2.2 网络分析工具
• 3.1.2.3 MYP基因启动子结构分析
• 3.1.2.4 MYP转录调控区中转录因子结合序列
• 3.2 MYP基因下游分析
• 3.2.1 测序结果
• 3.2.2 SNPs检测
• 3.2.3 结果分析
• 3.2.3.1 序列处理
• 3.2.3.2 同源性比对
• 3.2.3.3 SNP分析
• 3.2.3.4 多聚腺苷作用信号分析
• 4 讨论
• 4.1 MYP基因上游
• 4.2 MYP基因下游
• 5 小结
• 参考文献
• 第三章 海胆MYP基因内含子系列的获得及分析
• 1 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验试剂及配制
• 2 方法
• 2.1 海胆总DNA的提取
• 2.2 DNA样品的检测
• 2.2.1 琼脂糖凝胶电泳检测
• 2.2.2 分光光度法检测
• 2.3 引物设计
• 2.4 PCR扩增条件
• 2.5 测序及序列分析
• 3 结果与分析
• 3.1 测序及序列分析
• 3.1.1 内含子5、6,外显子6
• 3.1.1.1 测序结果
• 3.1.1.2 序列分析
• 3.1.2 内含子11
• 3.1.2.1 测序结果
• 3.1.2.2 序列分析
• 3.1.3 内含子14、15,外显子15
• 3.1.3.1 测序结果
• 3.1.3.2 序列分析
• 3.1.4 内含子16
• 3.1.4.1 测序结果
• 3.1.4.2 序列分析
• 3.1.5 内含子17
• 3.1.5.1 测序结果
• 3.1.5.2 序列分析
• 3.1.6 内含子18
• 3.1.6.1 测序结果
• 3.1.6.2 序列分析
• 3.1.7 内含子20
• 3.1.7.1 测序结果
• 3.1.7.2 序列分析
• 3.2 内含子20的SNPs分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 附录
• 附录A 常用缩写词及英汉对照
• 附录B MYP基因mRNA及上下游、部分内含子序列
• 致谢
• 作者简介