血清miRNA定量方法的建立及其在肝相关疾病诊断中的应用

论文摘要

背景/目的:microRNA （miRNA）是一类长度为20—24个核苷酸的非编码小分子RNA,与靶基因3’端非编码区不完全配对,从而抑制靶基因mRNA的翻译,影响个体发育、细胞凋亡、细胞增殖和分化等生命活动,与肿瘤的发生、转移和耐药等病理进程密切相关。近年来研究发现,血清miRNA符合疾病诊断标志物的要求。miRNA在肝相关疾病中也起到重要作用。本文就血清miRNA在中毒肝损伤、肝细胞癌和乙肝病人中的差异表达进行分析。方法:采用实时荧光定量PCR技术对101例病人血清样本（分别为正常血清样本、中毒引起肝损伤病人血清、肝细胞癌病人血清和乙肝病人血清）差异表达分析。结果:首先建立了一个可靠、有效的血清miRNA定量方法。我们发现,与正常血清相比,miR-122在中毒肝损伤病人血清中呈上调趋势,且当ALT>600 U/L时,miR-122的上调倍数和ALT值之间有较好的相关性。在肝癌病人血清中ALT值和miR-122之间呈现出不规律的变化,且其中10.2%的病人血清中miR-122呈下调趋势。乙肝病人的血清中ALT值和miR-122之间也呈现出不规律的变化,且有38.9%的病人血清中miR-122呈下调趋势。结论:通过对中毒肝损伤、肝细胞癌和乙肝病人血清中miR-122的研究,提示miR-122在肝脏中发挥重要的作用,并可能参与了相关疾病的发生发展过程。扩展了我们对肝相关疾病生物学机制的了解,为今后肝相关疾病的miRNA靶向治疗提供依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 插图目录
• 表格目录
• 缩略语表
• 第一章 文献综述
• 1 miRNA 概述
• 1.1 miRNA 的产生
• 1.2 miRNA 的功能
• 1.3 miRNA 作用机制
• 1.4 血清循环miRNA
• 2 血清循环miRNA 与疾病诊疗
• 2.1 血清循环miRNA 与肿瘤诊断
• 2.2 血清循环miRNA 与产前诊断
• 2.3 血清循环miRNA 与其他疾病
• 3 血清miR-122 与肝相关疾病诊疗
• 4 实时荧光定量PCR 与血清miRNA 定量
• 4.1 荧光定量PCR 的概念和原理
• 4.2 荧光定量PCR 类型
• 第二章 研究内容和意义
• 1 研究目的和意义
• 2 研究的主要内容
• 3 实验流程图
• 第三章 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 血清样本
• 1.2 酶与试剂
• 2 miRNA 序列和内参基因序列及引物
• 3 反转录-荧光定量PCR（qRT-PCR）
• 4 miRNA 测序分析
• 4.1 PCR 产物回收
• 4.2 连接
• 4.3 重组质粒的转化
• 4.4 重组质粒菌落PCR 验证
• 4.5 重组质粒提取
• 4.6 测序及序列比对分析
• 5 数据处理及统计分析
• 第四章 结果和分析
• 1 血清miRNA 定量方法的建立
• 1.1 血清miRNA qRT-PCR
• 1.2 血清miRNA 测序
• 1.2.1 重组子菌落PCR 验证
• 1.2.2 血清miRNA 测序结果
• 1.3 正常人血清miRNA 定量分析
• 2 中毒肝损伤血清中miRNA 的差异表达
• 2.1 血清miRNA 与ALT 水平的关系
• 2.2 miR-122 与血清ALT 的相关性
• 2.3 血清miR-122 与ALT 水平在中毒肝损伤治疗中的关系
• 3 肝癌血清中miR-122 的差异表达
• 4 乙肝血清中miR-122 的差异表达
• 5 肝癌和乙肝病人血清ALT 值和miR-122 上调分布情况
• 第五章 讨论
• 1 血清miRNA 的定量方法
• 2 miR-122 与肝相关疾病的关系
• 3 U6 snRNA 在肝细胞癌病人血清中的表达
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢