15个梨品种S基因型的鉴定及2个梨S基因的全长cDNA克隆

论文摘要

梨是典型的配子体自交不亲和植物,绝大多数品种自花授粉不能结实或结实率很低,生产上必需合理配置授粉树或人工授粉才能获得理想的产量。配置授粉树时首先要考虑品种的S基因型,S基因型相同的品种杂交不亲和,否则为杂交亲和。囚此确定不同品种的S基囚型将为授粉品种配置及良种选育提供重要的科学依据。为了鉴定中国梨品种的S基因型,获得中国梨新S基因的全长序列,本研究以15个中国梨品种为试验材料开展了自交不亲和性的分子生物学研究,并获得了以下结果：1.以新疆梨品种‘兰州花长把’、‘张掖长把’、‘贵德长把’,秋子梨品种‘龙香’、‘青面’、‘黄面’、‘早蜜’,白梨品种‘大面黄’、‘无籽黄’、‘大青皮’、‘金锤子’、‘半斤酥’和‘水冬瓜’,砂梨品种‘云南宝珠’、‘满顶雪’等15个品种为试验材料,分别提取基因组DNA,用特异引物’FTQQYQ’和’anti-IIWPNV’进行PCR扩增,结合DNA测序技术,鉴定了这些品种的S基因型,分别为：S19S22、S19S22、S19S22,S16SX、S1S18、S1S12、S19S29,S1S19、S28S16、S34S19、S16S19、S5S21、S15Sy,S22SX、S4S15。2.采用引物’TGCCTCGCTCTTGAACAA’和’anti-IIWPNV’对‘水冬瓜’梨的基因组DNA进行PCR扩增,从中分离鉴定了1个新的梨S基囚,即S45。S45基因信号肽、高变区、保守区1（C1）和保守区2（C2）分别由27个、15个、11个和10个氨基酸组成,且在C1区出现一处新的氨基酸替换。在推导的氨基酸水平上,S45基因和梨S26的相似性最高,但高变区有5个氨基酸差异,同时确定‘水冬瓜’梨的S基因型为S15S45。3.采用引物’TGCCTCGCTCTTGAACAA’和’anti-IIWPNV’对‘龙香’和‘云南宝珠’梨的基因组DNA进行PCR扩增,从中分离鉴定了1个新的梨S基因,即S42。经比对发现新基因与欧洲花楸的SaucS27基因相似性最高,再根据欧洲花楸的SaucS27基囚序列设计新的特异引物进行PCR扩增,从中分离了一条1044bp的序列,分析显示为梨S42的基因组全长序列,其中335bp为内含子序列,同时确定‘龙香’和‘云南宝珠’梨的S基因型分别为S16S42和S22S42。4.以‘云南宝珠’梨雌蕊为试材提取总RNA,通过RT-PCR结合RACE技术获得了梨S22和S42的全长cDNA序列。S42基因的全部编码序列为681bp,编码227个氨基酸；S42基因的全部编码序列为678bp,编码226个氨基酸。生物信息学软件分析结果表明,S22和S42两个基因都具有梨S-RNase基因的序列特征,由5个保守区和一个高变区、8个保守的半胱氨酸残基和2个保守的组氨酸残基组成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 1 绪言
• 1.1 自交不亲和的类型及特点
• 1.1.1 同型自交不亲和
• 1.1.2 异型自交不亲和
• I.1.3 自交不亲和的表现形式
• 1.2 自交不亲和性的分子基础
• 1.2.1 孢子体自交不亲和性的分子基础
• 1.2.2 配子体自交不亲和性的分子基础
• 1.3 自交不亲和性进化的研究进展
• 1.4 克服自交不亲和的方法
• 1.4.1 授粉法
• 1.4.2 染色体加倍
• 1.4.3 化学处理法
• 1.4.4 物理处理法
• 1.4.5 其他克服自交不亲和的方法
• 1.5 梨自交不亲和基因型的鉴定方法
• 1.5.1 田间授粉法
• 1.5.2 亲缘推测法
• 1.5.3 花粉管伸长观测鉴定法
• 1.5.4 生物技术鉴定法
• 1.6 本研究的目的意义及技术路线
• 1.6.1 目的意义
• 1.6.2 技术路线
• 2 部分中国梨品种S基因型的鉴定
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要试剂及设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 梨基因组DNA提取及纯化
• 2.2.2 梨基因组DNA检测
• 2.2.3 梨S基因PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的回收
• 2.2.5 制备感受态细胞
• 2.2.6 载体连接
• 2.2.7 质粒转化感受态细胞
• 2.2.8 质粒DNA抽提
• 2.2.9 特异扩增检测
• 2.2.10 序列分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 梨基因组DNA的质量检测
• 2.3.2 梨S-RNase特异扩增分析
• 2.3.3 测序结果分析
• 2.4 小结与讨论
• 3 新的梨S基因的分离鉴定
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 主要试剂及设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 梨S基因特异扩增
• 3.2.2 PCR产物回收
• 3.2.3 T载体连接
• 3.2.4 质粒转化感受态细胞
• 3.2.5 特异扩增检测
• 3.2.6 序列分析及新序列提交
• 3.3 结果与分析
• 42等位基囚的分离与鉴定'>3.3.1 梨S₄₂等位基囚的分离与鉴定
• 45等位基因的分离与鉴定'>3.3.2 梨S₄₅等位基因的分离与鉴定
• 3.4 小结与讨论
• 42-RNase基因的全长基因组序列的分离克隆'>4 梨S₄₂-RNase基因的全长基因组序列的分离克隆
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 试验材料
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 引物设计
• 4.2 实验方法
• 42-RNase基因的PCR扩增'>4.2.1 S₄₂-RNase基因的PCR扩增
• 4.2.2 PCR产物回收、克隆、转化
• 4.2.3 特异引物检测
• 4.3 结果与分析
• 42-RNase特异扩增分析'>4.3.1 S₄₂-RNase特异扩增分析
• 4.3.2 测序结果分析
• 4.4 小结与讨论
• 22和S₄₂全长cDNA序列的分离克隆'>5 梨S₂₂和S₄₂全长cDNA序列的分离克隆
• 5.1 试验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 主要仪器和试剂
• 5.1.3 引物的设计及合成
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 雌蕊总RNA的提取及检测
• 5.2.2 cDNA第一链的合成
• 5.2.3 通过3'RACE获得S基因全长cDNA序列
• 5.3 结果与分析
• 5.4 结论与讨论
• 6 结论与创新
• 6.1 结论
• 6.2 创新点
• 参考文献
• 附录A 提交的序列信息
• 附录B 主要试剂配制
• 附录C 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢