欧文氏杆菌CXJZ95-198非纤维素降解特性及manA基因的克隆研究

论文摘要

生物法提取草本纤维能有效降低化学方法对环境造成的严重污染,降低生产成本,提高产品质量,是草本纤维利用的发展方向。甘露聚糖酶在非纤维素降解中具有重要作用,在造纸、纺织、食品、医药、石油等领域具有广阔的应用前景。 E.carotovora CXJZ95—198是迄今报道草本纤维提取效率最高的菌种。本文对该菌种的单糖利用、草本纤维提取过程中非纤维素物质脱除规律与方式等进行了深入研究;并对其manA基因进行了克隆、生物信息学分析与表达研究。结果如下: 该菌株嗜好甘露糖,使精制苎麻纤维中不含甘露糖,甘露聚糖酶在该菌株的草本纤维原料生物提取过程中发挥了重要的作用。草本纤维原料接种该菌种后,通过“非纤维素物质培养菌-菌分泌酶-酶降解非纤维素物质”的螺旋式生化反应,降解非纤维素物质。草类原料发酵液糖类、不溶性有机物等在发酵6—8hr达到最高,发酵液中大分子和不溶性物质占有机质总量的90%以上,发酵过程可以脱除草本纤维原料重量8%—11%的非纤维素物,能使原料中的非纤维素物质发生块状崩溃而脱落。进一步证实了刘正初先生提出的“块状崩溃”假说。 采用优化的Sau3AI部分酶切条件,获得2—5kb DNA片断,直接用来构建基因组文库,获得15000个转化子,筛选到了8个阳性克隆。选取DNA分子量最小的pT5质粒测序,获得了包含manA基因、长度为1844bp片断的全碱基序列。PCR分析表明这8个阳性克隆含有相同的manA基因。 初步确定了E.carotovora基因组序列位点4449729 bp上游1.3kb就是manA基因。这是首次明确欧文氏杆菌基因组该位点的功能。 本manA基因的ORF为1137bp,与其它来源的manA基因同源性很低,是一新manA基因。ORF上游没有发现典型的启动子结构,-8位存在SD序列。该基因已登陆GenBank,登陆号为DQ364440。 本manA基因编码含378AA、分子量41.892KD的蛋白质。可能在N端存在27 AA的信号肽。该蛋白的结构以α—螺旋（35%）和无规则卷曲（51.85%）为主,具有两个结构域,N端为催化域,胞外蛋白,属糖苷水解酶第26类。 本ManA酶与其它来源的甘露聚糖酶AA序列存在一定的同源性,与芽孢杆菌甘露聚糖酶AA相似性最高（50—52%）,与其它来源的甘露聚糖酶AA相似性低（<30%）。 成功构建了pET表达载体并对其表达调控进行了研究。信号肽对蛋白质的分泌具有重要意义。IPTG浓度与诱导时间、诱导温度对manA的表达都存在明显影响。随着IPTG浓度的提高,胞外甘露聚糖酶活力逐步提高,最适IPTG终浓度为1mM。诱导温度较高时（37℃）,诱导效果更加明显。在IPTG诱导的情况下,有信号肽载体能同时强表达分子量42KD左右的目标带与47KD左右的另外一条带,无信号肽者只表达一条目标蛋白带。 该甘露聚糖酶的最适底物为葡萄甘露聚糖,最适pH值为7.5,最适温度为50℃。 该研究明确了本菌种草本纤维高效提取机理,克隆到了一个新mamA基因,明确了E.carotovora 4449729 bp上游1300bp位点功能。

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.1.1 生物法提取草本纤维是国内外生物质产业的发展方向
• 1.1.2 CXJZ95-198菌株提取草本纤维表现出广谱性和高效性
• 1.1.3 甘露聚糖的分子结构与降解
• 1.1.4 甘露聚糖酶的应用前景十分广阔
• 1.2 国内外甘露聚糖酶研究现状
• 1.2.1 甘露聚糖酶的来源
• 1.2.2 甘露聚糖酶的性质
• 1.2.3 甘露聚糖酶的分类、结构分析
• 1.2.3 甘露聚糖酶表达条件的优化
• 1.3 国内外甘露聚糖酶基因的分子遗传学研究现状
• 1.3.1 甘露聚糖酶基因克隆
• 1.3.2 甘露聚糖酶基因的结构分析
• 1.4 Erwinia属菌种的基因组学研究现状
• 第二章 CXJZ95—198非纤维素降解特性研究
• 2.1 试验材料与方法
• 2.1.1 试验材料
• 2.1.2 试验方法
• 2.2 试验结果
• 2.2.1 CXJZ95-198的营养特性
• 2.2.2 草料发酵过程中有机物的变化规律
• 2.2.3 草料加工过程中的重量变化规律
• 2.2.4 生物脱胶苎麻精干麻中非纤维素物质残留量
• 2.3 结论与讨论
• 2.3.1 草本纤维生物提取工艺的基本特征
• 2.3.2 “块状崩溃”假说的基本内涵
• 2.3.3 甘露聚糖酶是“块状崩溃”假说的关键因子
• 第三章 CXJZ95-198甘露聚糖酶基因的克隆与表达
• 3.1 实验方法和材料
• 3.1.1 试验材料
• 3.1.2 试验方法
• 3.2 试验结果
• 3.2.1 基因组DNA部分酶切的条件优化
• 3.2.3 阳性克隆的鉴定
• 3.2.4 甘露聚糖酶基因的DNA序列
• 3.2.5 甘露聚糖酶基因的序列分析
• 3.2.6 表达载体的构建
• 3.2.7 表达载体的序列鉴定
• 3.2.8 不同表达载体的表达情况研究
• 3.2.9 不同IPTG浓度与温度对表达的影响
• 3.2.10 重组甘露聚糖酶的酶学研究
• 3.3 结论与讨论
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录
• 附录1.氨基酸的多序列比对（CLUSTAL W（1.82） multiple sequence alignment）
• 附录2.E.carotovora基因组4449335—444967序列的编码情况
• 附录3.所克隆基因GenBank登陆号与序列DQ364440
• 附件4：结构域预测
• 附件5：pT5序列测定
• 附件6：FR1序列测定
• 附件7：FR2序列测定
• 附件8：FR4序列测定
• 作者简历