免疫淀粉微球的制备

论文摘要

肝特异性脂蛋白(liver specific lipoprotein, LSP)在乙型肝炎免疫发病机理中起一定作用，是肝损伤的主要靶抗原。本文将肝特异性脂蛋白抗体（LSP抗体）与淀粉微球交联，制备了免疫淀粉微球，通过LSP抗体与抗原LSP的特异性反应使免疫淀粉微球具有了主动靶向肝脏的功能，保护肝细胞，减少乙肝患者肝损伤，淀粉微球还可载药使药物选择性浓集于病变部位，而不分布或少分布在正常部位，为探索治疗乙型肝炎的新方法提供参考。本研究采用蔗糖密度梯度离心法从小鼠新鲜肝脏中提取LSP，以LSP为抗原免疫新西兰大白兔，制备LSP抗体。以可溶性淀粉为原料，采用反相微乳法合成淀粉微球，利用环氧氯丙烷活化淀粉微球，将LSP抗体与活化的淀粉微球交联，得到免疫淀粉微球。小鼠肝脏冰冻切片的直接荧光抗体染色实验鉴定了所制备的LSP抗体具有特异性。以环氧密度(epoxy density, EPD)为指标，考察了活化过程中的影响因素，研究得出：1．反应初期，活化淀粉微球上环氧密度随着时间的增加和温度的升高而增大；反应进行到一定时间后，活化淀粉微球上环氧密度开始降低，尤其是反应温度较高时，这种降低的趋势更为明显。在30℃下反应5h，可获得最高环氧密度。2．活化淀粉微球的环氧密度随着反应体系中氢氧化钠浓度的增大先增大后减小，当氢氧化钠的浓度为2mol/L时，环氧密度最大。3．在一定范围内，反应体系中环氧氯丙烷的加入量越多，活化淀粉微球的环氧密度越高，当环氧氯丙烷用量为0.35mL/g淀粉微球时，环氧密度达到最大，继续增加环氧氯丙烷的用量环氧密度也不会继续增加。通过单因素实验，优化了LSP抗体与活化淀粉微球交联的条件，适宜交联的缓冲液pH范围为9.4~9.7，交联反应的合适时间为17~20h。在优化条件下，活化淀粉微球与LSP抗体交联，经测定单位淀粉微球交联LSP抗体的量为7.7mg/g。免疫淀粉微球对抗原LSP的结合实验表明：单位免疫淀粉微球对抗原LSP的结合量为0.5mg/g，说明免疫淀粉微球具有了主动靶向性，并且表明与淀粉微球交联的抗体保持了较高的活性，抗体和淀粉微球交联后不影响与抗原的结合。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 绪论
• 前言
• 1.1 抗原抗体概述
• 1.1.1 抗原的基本概念
• 1.1.2 抗原的基本性质
• 1.1.3 抗体基本概念
• 1.1.4 抗体的基本结构
• 1.2 LSP 与 LSP 抗体概述
• 1.2.1 LSP
• 1.2.2 LSP 抗体
• 1.2.3 LSP 和 LSP 抗体在乙型肝炎发病机理中所起的作用
• 1.3 免疫微球概述
• 1.3.1 免疫微球的发展史
• 1.3.2 免疫微球的结构和性质
• 1.3.3 免疫微球的种类
• 1.3.3.1 磁性免疫微球
• 1.3.3.2 发光免疫微球
• 1.3.3.3 其它几种免疫微球
• 1.3.4 载体微球的种类和性质
• 1.3.5 载体微球的制备
• 1.3.6 载体微球与配基的结合
• 1.3.6.1 物理吸附法
• 1.3.6.2 共价交联法
• 1.3.7 免疫微球的用途
• 1.3.7.1 免疫微球检测技术在食品安全领域中的应用
• 1.3.7.2 免疫微球在医学和生物领域中的应用
• 1.4 淀粉微球概述
• 1.5 淀粉微球的制备方法
• 1.5.1 物理法
• 1.5.2 化学法
• 1.5.3 反相微乳法
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料和仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 小鼠 LSP 的制备
• 2.2.1.1 细胞膜抽提液的配制
• 2.2.1.2 双缩脲试剂的配制
• 2.2.1.3 小鼠 LSP 的提取
• 2.2.1.4 双缩脲法测定小鼠 LSP 的浓度
• 2.2.1.5 小鼠 LSP 的鉴定
• 2.2.2 LSP 抗体的制备
• 2.2.2.1 弗氏不完全佐剂的配制
• 2.2.2.2 钠氏试剂的配制
• 2.2.2.3 兔子的免疫
• 2.2.2.4 抗血清的制备
• 2.2.2.5 LSP 抗体的提取
• 2.2.2.6 LSP 抗体的透析除盐
• 2.2.2.7 LSP 抗体的鉴定
• 2.2.2.8 LSP 抗体浓度的测定
• 2.2.2.9 荧光抗体的制备
• 2.2.2.10 LSP 抗体特异性鉴定
• 2.2.3 淀粉微球的制备
• 2.2.4 淀粉微球表征
• 2.2.5 免疫淀粉微球的制备
• 2.2.5.1 淀粉微球的活化
• 2.2.5.2 环氧基含量的测定
• 2.2.5.3 反应温度与反应时间对环氧密度的影响
• 2.2.5.4 反应体系中氢氧化钠的浓度对环氧密度的影响
• 2.2.5.5 环氧氯丙烷用量对环氧密度的影响
• 2.2.5.6 活化淀粉微球与 LSP 抗体的交联
• 2.2.5.7 缓冲液 pH 值对活化淀粉微球与 LSP 抗体交联的影响
• 2.2.5.8 反应时间对活化淀粉微球与 LSP 抗体交联的影响
• 2.2.5.9 免疫淀粉微球与抗原的特异性分析
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 小鼠 LSP 的制备
• 3.1.1 小鼠 LSP 的浓度测定
• 3.1.2 小鼠 LSP 鉴定
• 3.2 小鼠 LSP 抗体的制备
• 3.2.1 小鼠 LSP 抗体的鉴定
• 3.2.2 LSP 抗体浓度的测定
• 3.2.3 荧光抗体的制备
• 3.2.4 LSP 抗体特异性鉴定
• 3.3 淀粉微球表征
• 3.4 免疫淀粉微球的制备
• 3.4.1 淀粉微球的活化
• 3.4.2 反应温度与反应时间对环氧密度的影响
• 3.4.3 反应体系中氢氧化钠的浓度对环氧密度的影响
• 3.4.4 环氧氯丙烷用量对环氧密度的影响
• 3.4.5 缓冲液 pH 值对活化淀粉微球与 LSP 抗体交联的影响
• 3.4.6 交联反应时间对活化淀粉微球与 LSP 抗体交联的影响
• 3.4.7 优化条件下活化淀粉微球与 LSP 抗体的交联
• 3.4.8 免疫淀粉微球与抗原的特异性分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢