细菌内同源重组构建Ad-hNGFβ腺病毒质粒

论文摘要

目的 细菌内同源重组制备含hNGFβ基因的重组腺病毒质粒,在293细胞内包装扩增后纯化重组腺病毒。方法 将hNGFβ外源性核酸片段插入到经Xma Ⅰ与Xba Ⅰ酶切的pBluescriptⅡ sk（+）,构建成转移质粒pBluescript Ⅱ sk（+）—hNGFβ,将其与穿梭质粒pShuttle-CMV各自经Kpn Ⅰ和Not Ⅰ双酶切,酶切产物定向重组,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-hNGFβ。将该穿梭质粒经Pme Ⅰ酶切后,转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183,重组为pAdEasy-1-hNGFβ,经酶切鉴定正确后,用Lipofect介导pAdEasy-1-hNGFβ转染Ad293细胞,包装成重组腺病毒Ad-hNGFβ,用PCR进行鉴定。透析纯化后的腺病毒采用紫外分光光度计进行滴度测定,测得滴度为2.24×1012PFU/L。结果 （1） 线性化的pShuttle-CMV-hNGFβ转化含pAdEasy-1的感受态细菌BJ5183,24h后获得了30%阳性重组质粒,经酶切得到一条大于20kb的大片段和一条4.5kb的特征性条带。（2）重组腺病毒质粒转染Ad293细胞,第15d细胞出现病变,扩增后,经CsCl密度梯度离心获得2.24×1012PFU/L的高滴度腺病毒,经PCR鉴定正确。结论 应用细菌内同源重组能快速构建含hNGFβ基因的重组腺病毒载体Ad-hNGFβ,酶切鉴定,包装为高滴度的重组腺病毒Ad—hNGFβ,为hNGFβ基因的应用研究奠定了基础。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、引言
• 四、正文
• 1、材料和方法
• 2、结果
• 3、讨论
• 4、结论
• 5、附图
• 6、参考文献
• 五、综述
• 1、正文
• 2、参考文献