西瓜噬酸菌致病相关基因pyrG与hpaP的功能分析

论文摘要

西瓜噬酸菌（Acidovorax citrulli, Ac）引起的细菌性果斑病（bacterial fruit blotch of watermelon, BFB）是一类为害葫芦科植物的重要细菌病害,在世界的大多数国家和地区都有分布,造成严重的经济影响。西瓜噬酸菌也是我国的检疫性有害生物,目前关于该病原物的研究主要集中在检测防治方面,但是关于它的致病机制以及侵染途径方面的研究相对较少。因此本研究的目的就是克隆致病相关基因,并对其进行功能分析。利用转座子（Mini-Tn5）对Acidovorax citrulli strain xjL12 （Ac xjL12）进行转座诱变,构建了西瓜噬酸菌Ac xjL12的转座子插入文库。以接种哈密瓜幼苗的方法筛选得到两株株致病力完全丧失的突变株Δxj48,通过亚克隆的方法,鉴定了Δxj13、Δxj48的Mini-Tn5插入位点分别为pyrG基因、hpaP基因。利用自杀载体pVIK112,应用两亲交配的方式,构建了插入失活突变体ΔpyrG和ΔhpaP,并对其功能进行了初步分析。研究表明ΔpyrG、ΔhpaP丧失了对哈密瓜幼苗的致病性,这个结果与Δxj13、Δxj48一致；通过基因互补,分别构建了互补菌株pyrG hb、hpaPhb,互补菌株都基本恢复了对哈密瓜子叶的致病性。分别将野生型、突变株以及互补菌株接种烟草,发现Δxj13、Δxj48、ΔpyrG、AhpaP、hpaPhb都丧失了引起过敏性反应的能力,而pyrGhb恢复引起过敏性反应的能力；随后还对突变体的其他表型进行了研究,发现基因pyrG、hpaP突变后影响了AcxjL12的游动性、生物膜的形成能力,还影响了病原菌的定殖能力；反转录差异显示hpaP基因的突变对hrcV基因的表达有影响,pyrG基因的突变对hisD基因的表达有影响；MMX培养基中添加组氨酸的生长曲线测定表明pyrG基因的突变影响西瓜噬酸菌对组氨酸的利用。证实了西瓜噬酸菌中的pyrG、hpaP基因与该细菌的致病力相关,在其生长过程和侵染过程中起着不可缺失的作用。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 西瓜噬酸菌研究进展
• 1 分类地位
• 2 病原生物学
• 3 为害症状
• 4 检测与防治
• 4.1 种子检测
• 4.2 田间管理
• 4.3 化学防治
• 4.4 生物防治
• 5 侵染循环
• 第二章 CTPS研究进展
• 第三章 细菌Ⅲ型分泌系统研究进展
• 1 细菌分泌系统简介
• 2 细菌Ⅲ型分泌系统
• 2.1 T3SS的结构
• 2.2 T3SS分泌有关的蛋白质
• 下篇 研究内容
• 第一章 西瓜噬酸菌致病相关基因pyrG的功能分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基及配制方法
• 1.1.3 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌基因组的小量提取
• 1.2.2 质粒的小量提取
• 1.2.3 大肠杆菌热激感受态的制备培养
• 1.2.4 大肠杆菌热激感受态转化
• 1.2.5 PCR扩增及产物回收
• 1.2.6 致病性丧失或减弱的突变体的筛选
• 1.2.7 转座子插入位点的鉴定
• 1.2.8 突变体△pyrG的构建及验证
• 1.2.9 功能互补菌株pyrGhb的构建及验证
• 1.2.10 致病性的测定
• 1.2.11 烟草过敏性反应（HR）测定
• 1.2.12 生物膜的测定
• 1.2.13 游动性的测定
• 1.2.14 RNA的提取和RT-PCR
• 1.2.15 生长速率的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 AcxjL12突变体的筛选
• 2.2 AcxjL12突变体△xj13的Mini-Tn5的插入位点鉴定
• 2.3 △pyrG的构建及验证
• 2.5 pyrGhb的构建及验证
• 2.6 基因PyrG的突变影响了AojxL12的致病性
• 2.7 基因PyrG的突变影响了A0jxL12的HR反应
• 2.8 基因pyrG的突变影响了AcxjL12的生物膜形成能力
• 2.9 基因pyrG的突变影响了AcxjL12的游动性
• 2.10 基因pyrG的突变影响了AcxjL12中his基因的表达
• 2.11 基因pyrG的突变影响了AcxjL12对组氨酸的利用
• 3 讨论
• 第二章 西瓜噬酸菌致病相关基因hpaP的功能分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌株和质粒
• 1.1.2 培养基及配制方法
• 1.1.3 引物
• 1.2 方法
• 1.2.1 细菌基因组的小量提取
• 1.2.2 质粒的小量提取
• 1.2.3 大肠杆菌热激感受态的制备培养
• 1.2.4 大肠杆菌热激感受态转化
• 1.2.5 PCR扩增及产物回收
• 1.2.6 Southern杂交验证
• 1.2.7 致病性丧失或减弱的突变体的筛选
• 1.2.8 转座子插入位点的鉴定
• 1.2.9 突变体△hpaP的构建及验证
• 1.2.10 功能互补菌株hpaPhb的构建及验证
• 1.2.11 致病性的测定
• 1.2.12 烟草过敏性反应（HR）测定
• 1.2.13 生物膜的测定
• 1.2.14 游动性的测定
• 1.2.15 RNA的提取和RT-PCR
• 1.2.16 细胞形态观察
• 2 结果与分析
• 2.1 AcxjL12突变体的筛选
• 2.2 AcxjL12突变体△xj48的Mini-Tn5的插入位点的鉴定
• 2.3 △hpaP的构建及验证
• 2.4 hpaP突变体的Southern杂交验证
• 2.5 hpaPhb的构建及验证
• 2.6 基因hpaP的突变影响了Ac xjL12的致病性
• 2.7 基因hpaP的突变影响了Ac xjL12的HR反应
• 2.8 基因hpaP的突变影响了Ac xjL12的生物膜形成能力
• 2.9 基因hpaP的突变影响了Ac xjL12的游动性
• 2.10 基因hpaP的RT-PCR结果
• 2.11 基因hpaP的突变影响了Ac xjL12胞外多糖类似物的积累
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢