大豆生物反应器表达融合蛋白CTB-LK

论文摘要

用植物表达药物蛋白具有很多优势,这些优势包括:较低的生产成本,储存和运输成本,热稳定性,不受人类病原生物污染,植物细胞的细胞壁作为生物保护膜,保护蛋白药物通过人体的胃部酸性不利环境,由于口服给药从而免去了注射剂的纯化及相关设备的消毒。尽管如此,植物表达的药物蛋白不易为人体的肠道所吸收,这一点成为这种药物有效给药的一大障碍。受体介导的口服给药系统为这一问题提了可能的解决办法。本研究利用霍乱毒素B-亚基（cholera toxin B-subunit, CTB）作为肠道黏膜转运载体,辅助药物蛋白穿过肠上皮细胞的运输,我们将CTB基因和蚓激酶（Lembrokinase, LK）的基因通过一段柔性连接肽相连,并使其在大豆细胞内表达。蚓激酶（LK）是一种从蚯蚓体内提出来的纤维蛋白酶,被广泛用作溶血栓药物。我们将CTB-LK融合基因克隆到植物表达载体pBI121内,并导入农杆菌菌株C58内。我们从几个方面改进了传统的农杆菌介导的大豆子叶节法转化体系。为得到高质量的子叶节外植体,我们改进了灭菌方法,用盐酸和次氯酸钠混合制得的氯气干法灭菌代替传统的溶液灭菌。为了提高转化效率,在共培养培养基内添加巯基类化合物,这种化合物能抑制植物对抗农杆菌的防卫反应导致的组织坏死,从而改善了T-DNA的转移。我们将生根培养基中生长素IBA的浓度降低到0.2mg/L,从而改善了生根率。经过了不定芽诱导,不定芽的伸长和生根过程,得到了22株具有卡那霉素抗性的大豆小苗。经PCR方法验证了有2株幼苗呈现转基因阳性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 免疫佐剂CTB
• 1.2.1 CTB 的结构功能及应用
• 1.2.2 CTB 在传统免疫反应中的应用
• 1.2.3 CTB 在基因工程中的应用
• 1.2.4 CTB 新的功能的探索
• 1.3 蚓激酶
• 1.3.1 蚓激酶的作用机理
• 1.3.2 蚓激酶的结构特征
• 1.4 植物生物反应器
• 1.4.1 转基因植物生产药物蛋白发展现状
• 1.4.2 植物生物反应器的优点
• 1.4.3 存在的问题及解决方法
• 1.4.4 转基因植物生产药物蛋白的表达策略
• 1.5 大豆遗传转化的研究进展
• 1.5.1 农杆菌介导法转化大豆的工作进展
• 1.5.2 大豆转基因的方法
• 1.5.3 农杆菌介导大豆的遗传转化存在的主要问题及解决办法
• 第二章 植物表达载体的构建
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 植物表达载体的构建
• 2.1.3 工程农杆菌的制备
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 LK 与CTB 的连接
• 2.2.2 植物表达载体 pBI121-CTB-LK 的构建
• 2.3 讨论
• 2.3.1 PCR 技术的一些经验
• 2.3.2 限制性酶切反应
• 2.3.3 植物表达的启动子
• 第三章 农杆菌介导的大豆子叶节法遗传转化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料与农杆菌
• 3.1.2 主要仪器与试剂
• 3.1.3 子叶节器官发生体系的优化
• 3.1.4 大豆农杆菌转化系统的优化
• 3.1.5 抗性植株的检测
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 子叶节器官发生体系的优化
• 3.2.2 大豆农杆菌转化系统的优化
• 3.2.3 程序化转化及筛选
• 3.2.4 抗性植株的检测
• 3.3 讨论
• 3.3.1 关于筛选压力
• 3.3.2 大豆的遗传转化方法
• 3.3.3 影响转化率的因素
• 3.3.4 假阳性现象
• 3.3.5 延迟筛选策略
• 3.3.6 再生苗的玻璃化现象
• 3.3.7 再生苗的移栽
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢