番木瓜芥子酶基因CpTGG1的表达和酶学特性

论文摘要

十字花科（Cruciferae）植物特有的硫代葡萄糖苷/芥子酶防御系统,赋予其在生态环境中的扩张优势,对病虫害有显著防御作用。在植物体内,芥子酶和硫代葡萄糖苷的分布相互隔离。当植物组织受到损伤时,芥子酶与底物硫代葡萄糖苷才会相遇,并降解底物产生异硫氰酸盐、硫氰酸盐、腈类或环硫腈、唑烷-2-硫酮等毒性化合物。硫代葡萄糖苷水解产物还在肿瘤和心脏病的预防方面有重要医药价值。番木瓜（Carica papaya）为番木瓜科作物,是热带重要的三大草本果树之一,番木瓜是目前十字花科以外唯一发现具有芥子酶活性的植物,同时还具有生氰葡萄糖苷酶活性。目前已发现番木瓜芥子酶基因CpTGG1、CpTGG2和CpTGG3,并在毕赤酵母中成功表达了CpTGG1和CpTGG2。生物信息学和生物化学研究表明,芥子酶可能起源于生氰葡萄糖苷酶。番木瓜芥子酶防御系统处于芥子酶进化的早期阶段,功能不完善,是研究芥子酶分子进化机制的好材料。本实验主要对番木瓜芥子酶CpTGG1进行深入研究,包括组织差异性表达、酶活特性、底物特异性及系统进化研究；证实CpTGG1芥子酶特性及其在芥子酶进化过程中的特殊价值。研究发现,CpTGG1在植物地上部表达,CpTGG2在根中特异表达,CpTGG3在花和种子中表达。毕赤酵母中表达的重组CpTGG1可以催化水解Sinigrin和苯甲基硫代葡萄糖苷,说明CpTGG1|的确属于芥子酶基因。序列比对分析表明,除了两个糖基化位点差异外,CpTGG1含有十字花科植物功能芥子酶保守氨基酸位点的共同特点。以Sinigrin为底物进行酶促反应,研究表明重组CpTGG1的Km和Vmax分别为2.82 mM和59.5μmol.min-1.mg protein-1, kcat/Km值为23 s-1.mM-1。采用多种底物验证了CpTGG1的O-β-葡萄糖苷酶活性,发现重组CpTGG1对O-β-葡萄糖苷2-NPG（邻硝基苯基-β-D-葡萄糖苷）和4-NPG（对硝基苯基-β-D-葡萄糖苷）存在特异性分解作用,并且不受Vc干扰。但无法分解β-葡萄糖苷n-OG （n-辛基-β-葡萄糖苷）和GV（香兰素糖苷）。系统发育分析表明CpTGGs均属于新型芥子酶MYRⅡ家族。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 硫代葡萄糖苷/芥子酶防御系统简介
• 1.1.1 硫代葡萄糖苷/芥子酶酶防御系统的特性
• 1.1.2 硫代葡萄糖苷简介
• 1.1.3 芥子酶的特性
• 1.1.4 硫代葡萄糖苷/芥子酶防御系统的起源进化
• 1.2 番木瓜的研究价值
• 1.3 毕赤酵母表达系统简介
• 1.4 组氨酸标签蛋白纯化技术简介
• 1.5 芥子酶活力测定方法简介
• 1.6 本实验研究目的及意义
• 1.7 实验技术路线
• 2 实验材料、试剂及仪器
• 2.1 植物材料
• 2.2 菌株与质粒
• 2.3 主要仪器
• 2.4 主要的试剂盒及药品
• 2.5 主要培养基及试剂配方
• 2.5.1 主要培养基配方
• 2.5.2 主要试剂配方
• 2.6 PCR扩增引物
• 3 实验方法
• 3.1 番木瓜芥子酶基因组织差异表达分析
• 3.1.1 RNA的提取
• 3.1.2 反转录合成cDNA第一链
• 3.1.3 反转录cDNA质量验证
• 3.1.4 番木瓜芥子酶基因CpTGGs组织差异表达RT-PCR分析
• 3.2 生物信息学分析
• 3.2.1 番木瓜芥子酶理化性质分析
• 3.2.2 番木瓜芥子酶亚细胞定位分析
• 3.2.3 CpTGGs与部分典型芥子酶、O-β-葡萄糖苷酶序列比对分析
• 3.2.4 芥子酶系统发育分析
• 3.3 毕赤酵母中表达番木瓜芥子酶基因
• 3.3.1 重组表达载体的构建
• 3.3.2 重组载体转化毕赤酵母
• 3.3.3 重组蛋白的大量表达
• 3.3.4 纯化重组蛋白
• 3.4 重组CpTGG1浓度测定及SDS-PAGE
• 3.4.1 重组CpTGG1蛋白浓度测定
• 3.4.2 重组蛋白CpTGG1 SDS-PAGE检测
• 3.4.3 重组蛋白CpTGG1分子量的计算
• 3.5 重组CpTGG1酶促动力学特性分析
• 3.6 重组CpTGG1底物特异性研究
• 4 实验结果与分析
• 4.1 番木瓜芥子酶基因组织差异表达分析
• 4.1.1 RNA提取结果
• 4.1.2 番木瓜芥子酶基因组织差异表达RT-PCR分析
• 4.2 生物信息学分析结果
• 4.2.1 番木瓜芥子酶CpTGGs的理化性质分析
• 4.2.2 番木瓜芥子酶CpTGGs信号肽预测分析
• 4.2.3 番木瓜芥子酶CpTGGs亚细胞定位预测
• 4.2.4 CpTGGs与部分典型芥子酶、O-β-葡萄糖苷酶序列比对结果分析
• 4.2.5 芥子酶系统发育分析
• 4.3 CpTGG1和CpTGG3克隆、载体构建及酵母表达结果分析
• 4.4 重组番木瓜芥子酶CpTGG1 SDS-PAGE检测分析
• 4.4.1 重组CpTGG1 SDS-PAGE检测
• 4.4.2 重组CpTGG1蛋白分子量的计算
• 4.5 重组CpTGG1酶学特性
• 4.5.1 重组CpTGG1蛋白浓度测定
• 4.5.2 重组CpTGG1酶学特性研究
• 4.6 重组CpTGG1底物特异性研究
• 5 讨论
• 5.1 关于芥子酶的组织表达差异性
• 5.2 关于硫代葡萄糖苷/芥子酶防御系统的调控机制
• 5.3 关于硫代葡萄糖苷/芥子酶的起源进化
• 5.4 关于番木瓜芥子酶对底物分解的特异性
• 5.5 关于番木瓜芥子酶基因的研究前景
• 6 结论
• 附录1:缩写词表（Abbreviation）
• 附录2:CpTGGs cDNA碱基序列比较
• 附录3:CpTGGs氨基酸序列比较
• 参考文献
• 致谢