产气荚膜梭菌β、ε毒素不同片段的融合表达及免疫原性研究

论文摘要

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens,CP）属梭状芽孢杆菌属,是一种重要的人兽共患病病原。该病的防控主要依赖于疫苗的免疫接种,现有的疫苗由全菌及类毒素灭活制备,存在注射剂量大、家畜接种局部反应较重等问题。鉴于以上原因,本试验试图融合表达β、ε毒素不同片段,并将表达产物免疫家兔,通过攻毒保护和血清中和试验比较其免疫原性,从而筛选出可提供足够免疫保护的毒素片段,以制备含有两种毒素保护性抗原的融合蛋白,为今后多价基因工程类毒素疫苗的研制奠定理论基础。为分析β﹑ε毒素不同截短片段的免疫原性,通过DNAstar软件分析两毒素蛋白质的二级结构,根据亲水性基团的分布,截取毒素成熟肽序列上不同片段,通过PCR扩增获得三个不同组合的融合基因并克隆入pET-32a（+）载体中,诱导表达得到三个重组融合蛋白,分别命名为ε1432-β1610、β419927-ε430889、β-ε。分别将融合蛋白以1mg/只的剂量免疫家兔,首免后14天以相同剂量加强免疫一次。分别测定首免后14天,二免后7天家兔血清的中和抗体效价,并于二免7天后分别以1MLD的产气荚膜梭菌C型毒素,D型毒素进行攻毒试验,测定攻毒保护结果。结果表明:对C型毒素,ε1432-β1610、β419927-ε430889、β-ε的一免血清均不能中和C型毒素,二免血清中只有β-ε免疫动物可中和1MLD的C型毒素,攻毒保护结果分别为0/4﹑0/4﹑2/4,由此推测β毒素的免疫保护性依赖于毒素全长的完整性。对D型毒素,ε1432-β1610、β419927-ε430889、β-ε的一免血清中和效价分别为4﹑1﹑40,二免血清中和效价分别为80﹑1﹑160,攻毒保护结果为4/4﹑1/4﹑4/4,由此推测ε,ε1432均可提供有效保护,而ε430889免疫原性弱,不能提供有效保护,表明ε毒素的主要保护性抗原位于N端的ε1432区域内。根据以上结果,构建了ε1432-β融合基因并获得表达。将获得的ε1432-β融合蛋白以0.1mg/只剂量免疫家兔,首免后14天加强免疫一次,测定血清中和效价及免疫攻毒结果。结果表明:对C型毒素,ε1432-β0.1mg/只免疫组一免血清中和效价为0,二免血清中和效价为16,攻毒保护结果为3/3。对D型毒素,一免血清中和效价为0,二免血清中和效价为0,攻毒保护结果为3/3。结果表明,ε1432-β融合蛋白可对β毒素提供足够保护,而对ε毒素不能保护,这与ε1432-β1610可对ε毒素提供保护的结果相矛盾。初步推测为毒素片段免疫原性的强弱主要依赖于其表位构象。当毒素表达蛋白越接近于其天然构象时,免疫原性越强,反之越弱。从ε1432-β1610到ε1432-β,ε1432片段的免疫原性于后者大为减低甚至丧失,推测当ε1432与片段较大的β融合时,其表位构象较大受到β毒素影响,故免疫原性变弱。比较β-ε到ε1432-β,β片段的免疫原性也有明显增强,推测是由于ε1432片段较小,对其表位构象的抑制作用也较小。这一推论有待相关实验进一步证实。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 插图及附表清单
• 缩略语中英文对照表
• 第一章 引言
• 1.1 研究目的和意义
• 1.2 产气荚膜梭菌研究进展
• 1.2.1 产气荚膜梭菌生物学特性
• 1.2.2 产气荚膜梭菌 β 毒素研究进展
• 1.2.3 产气荚膜梭菌 ε 毒素研究进展
• 1.2.4 产气荚膜梭菌疫苗研究进展
• 第二章 产气荚膜梭菌 β 毒素和 ε 毒素抗原表位分析
• 2.1 方法
• 2.2 结果
• 2.3 讨论与小结
• 第三章 不同片段产气荚膜梭菌 ε 毒素与 β 毒素融合基因的构建表达
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株及质粒
• 3.1.2 主要仪器和试剂
• 3.1.3 溶液的配制
• 3.2 方法
• 3.2.1 B型产气荚膜梭菌（C58-2）基因组的提取
• 3.2.2 融合基因的扩增
• 3.2.3 重组表达载体的构建及鉴定
• 3.2.4 重组菌的诱导表达及表达产物的鉴定
• 3.2.5 重组蛋白的Western blot分析
• 3.2.6 重组蛋白毒性测定及毒素中和试验
• 3.3 结果
• 1⁶10、β_419⁹27、ε、ε_1⁴32、ε_430⁸89扩增结果'>3.3.1 β、β_1⁶10、β_419⁹27、ε、ε_1⁴32、ε_430⁸89扩增结果
• 1⁴32-β_1⁶10，β_419⁹27-ε_430⁸89， β-ε 扩增结果'>3.3.2 融合基因 ε_1⁴32-β_1⁶10，β_419⁹27-ε_430⁸89， β-ε 扩增结果
• 3.3.3 重组表达载体的构建及鉴定
• 3.3.4 融合蛋白表达
• 3.3.5 重组蛋白的Western blot分析结果
• 3.3.6 重组蛋白毒性测定结果
• 3.4 讨论与小结
• 3.4.1 关于目的基因的选取
• 3.4.2 关于融合基因的构建
• 3.4.3 关于表达载体的选择
• 3.4.4 关于Western blot验证融合蛋白反应原性
• 3.4.5 关于重组蛋白 β-ε 毒性试验结果
• 第四章 不同产气荚膜梭菌 β-ε 融合蛋白免疫原性试验
• 4.1 材料
• 4.1.1 抗原
• 4.1.2 佐剂
• 4.1.3 毒素稀释液
• 4.1.4 试验动物
• 4.1.5 溶液配制
• 4.2 方法
• 4.2.1 包涵体提取
• 4.2.2 重组蛋白免疫程序
• 4.2.3 血清中和
• 4.2.4 家兔攻毒试验
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组蛋白免疫后血清中和效价
• 4.3.2 家兔攻毒结果
• 4.4 讨论与小结
• 4.4.1 包涵体提取
• 4.4.2 血清中和效价分析
• 4.4.3 攻毒保护分析
• 4.4.4 保护性抗原片段选取
• 1⁴32-β 融合蛋白表达与免疫原性试验'>第五章 产气荚膜梭菌 ε_1⁴32-β 融合蛋白表达与免疫原性试验
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株及质粒
• 5.1.2 抗原
• 5.1.3 佐剂
• 5.1.4 毒素稀释液
• 5.1.5 试验动物
• 5.2 方法
• 5.2.1 B型产气荚膜梭菌（C58-2）基因组的提取
• 5.2.2 融合基因的扩增
• 5.2.3 重组表达载体的构建及鉴定
• 5.2.4 重组菌的诱导表达及表达产物的鉴定
• 5.2.5 重组蛋白的Western blot分析
• 5.2.6 包涵体提取
• 5.2.7 重组蛋白毒性测定
• 5.2.8 重组蛋白免疫程序
• 5.2.9 血清中和
• 5.2.10 家兔攻毒试验
• 5.3 结果
• 1⁴32、β 片段扩增结果'>5.3.1 ε_1⁴32、β 片段扩增结果
• 1⁴32-β 扩增结果'>5.3.2 融合基因 ε_1⁴32-β 扩增结果
• 5.3.3 重组表达载体的构建及鉴定
• 5.3.4 重组菌的诱导表达鉴定结果
• 5.3.5 重组蛋白的Western blot分析结果
• 5.3.6 重组蛋白毒性测定结果
• 5.3.7 重组蛋白免疫后血清中和效价
• 5.3.8 家兔攻毒结果
• 5.4 讨论与小结
• 第六章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附图
• 作者简历