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口蹄疫新型疫苗研究

2020-11-28阅读(994)

口蹄疫新型疫苗研究

论文摘要

口蹄疫（foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouth diseasevirus,FMDV）引起的,偶蹄动物共患的烈性、急性、接触性传染病。尽管该病的死亡率低,但由于该病传染性极强,能迅速形成大范围流行,而导致发病地区、乃至该国的畜产品出口贸易停止,从而造成巨大的经济损失。免疫接种是预防和控制该病的主要措施,目前用于预防FMD的主要疫苗是传统的弱毒苗和灭活苗,虽然这些传统疫苗能够提供较好的保护,但存在制备费用高、潜在的散毒危险等缺点,使得这两种疫苗的使用一直都存在着一定的争议。因此,研制更安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点。鉴于此,本研究对FMDV新型疫苗设计进行了新的探索,以构建了伪狂犬病毒（PRV）为载体的重组PRV-FMDV新型基因工程疫苗,以西门利克森林病毒（SFV）为复制子的“自杀性”DNA疫苗和以杆状病毒为载体的重组病毒疫苗,并对构建的三种候选疫苗进行了免疫效力研究;克隆并表达了猪源髓细胞分化因子MyD88,并探讨了其作为分子佐剂在小鼠体内对FMDV DNA疫苗免疫效果的影响。主要研究内容如下:1、共表达0型口蹄疫衣壳前体蛋白P1及其多抗原合成表位FHG的重组伪狂犬病毒FHG/P1/PRV的构建和免疫原性研究根据已公布的O型口蹄疫抗原表位设计合成了多抗原表位肽基因fhg,将其插入到中间转移载体pIECMV中,获得重组中间转移质粒pIEFHG,将pIEFHG与本室构建的口蹄疫-伪狂犬重组病毒TK-/gG-/P1+基因组共转染猪肾细胞IBRS-2,通过空斑纯化得到了新型口蹄疫重组伪狂犬病毒株FHG/P1/PRV。结果表明,此重组病毒能同时表达具有生物学活性的O型口蹄疫衣壳前体蛋白P1以及多抗原合成表位肽FHG,并且伪狂犬病毒基因组上的多点插入表达并不影响其在宿主细胞上的增殖。将此疫苗免疫40日龄的仔猪,结果表明,重组病毒FHG/P1/PRV较之亲本株TK-/gG-/P1+,能够诱导较好的体液免疫和细胞免疫。并且由于FHG/P1/PRV病毒基因组中的gE基因被插入失活,因此该疫苗能够与国际通用的PRV鉴别诊断方法配合使用,这为此疫苗的推广奠定了基础。2、FMDV DNA疫苗的构建和免疫效果分别以pcDNA3.1+和pSCA1为载体,构建了表达O型FMDV空衣壳蛋白的常规DNA疫苗表达质粒pceCAP和“自杀性”DNA疫苗表达质粒pSCAI-eCAP,转染BHK-21细胞,Western blot检测证实两种表达质粒均能正确表达FMDV空衣壳蛋白VP0,VP3,和VP1。将pceCAP和pSCAI-eCAP分别以100μg/只免疫Balb/c小鼠,并对这两种疫苗的免疫效果进行了比较,发现“自杀性”DNA疫苗组产生的ELISA抗体和中和抗体明显高于常规DNA疫苗组的,且“自杀性”DNA疫苗能诱导更强的细胞免疫。捕狙⒔峁砻鳌白陨毙浴盌NA疫苗pSCAI-eCAP能完全保护小鼠抵抗FMDV同型强毒的攻击。是一种极具潜力的FMDV候选DNA疫苗。3、杆状病毒介导的表达FMDV空衣壳蛋白的重组病毒疫苗的构建以及免疫原性的研究杆状病毒不能感染哺乳动物细胞,但可以进入不同物种和组织来源的多种哺乳动物细胞,并在合适的哺乳动物启动子控制下表达外源基因。目前利用杆状病毒作为体内基因投送的载体已受到广泛的关注。但研究证实血清补体系统是杆状病毒体内基因转导过程中的主要抑制因素。因此,为了消除杆状病毒的补体敏感性,在本研究中利用水泡性口炎病毒G蛋白修饰杆状病毒。将含有CMV启动子驱动的编码FMDV空衣壳蛋白的整个读码框表达的基因克隆到杆状病毒转移载体pFast-VSV-G中,构建重组病毒Ac-V-eCAP。体外转导试验表明,构建的重组病毒均能高效转导哺乳动物细胞.将重组病毒分别以不同的剂量（109PFU,108PFU,107PFU）肌肉注射免疫小鼠,试验结果表明,无论是从体液免疫水平还是细胞免疫水平来比较,重组杆状病毒Ac-V-eCAP以109PFU的剂量免疫小鼠时,能够诱导最高的体液免疫水平和细胞免疫水平,具有较好的免疫效果。病毒血症结果表明,Ac-V-eCAP当以109PFU的剂量免疫小鼠时能够针对FMDV同型强毒株的攻击提供较好的保护（4/5）,但是还是略要低于灭活苗（5/5）。4、猪源髓细胞分化因子MyD88作为分子佐剂在小鼠体内对FMDV DNA疫苗免疫效果的影响通过cross-over PCR的方法从猪外周全血中克隆髓细胞分化因子MyD88,并对其序列进行分析。结果获得了髓细胞分化因子MyD88,全长882bp,序列测定及同源性分析表明其与GenBank中报道的牛以及人的髓细胞分化因子基因同源性较高,同源性分别为89%和87%;与人,鼠对应功能域的氨基酸序列的分析结果表明,death区,猪源MyD88与人、鼠源MyD88同源性分别为77.3%,72.7%。TIR区,猪源MyD88与人、鼠源MyD88同源性分别为97.8%,91%。结合分子建模的结果,预测了猪源MyD88蛋白death区位于40-105aa.,TIR区位于158-291aa.。将表达猪源MyD88基因的表达盒插入FMDV DNA疫苗pceCAP中,获得共表达质粒pcMyD88-eCAP,将pcMyD88-eCAP和pceCAP分别以100μg/只免疫Balb/c小鼠,并对这两种疫苗的免疫效果进行了比较,结果无论体液免疫还是细胞免疫,共表达质粒pcMyD88-eCAP较之普通质粒无显著免疫增强效应。这说明猪源MyD88蛋白可能在小鼠体内活性极低,不能激发天然免疫反应。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 缩略语表（Abbreviation）
  • 第1章 文献综述
  • 1.1 FMD的危害及流行病学特点
  • 1.1.1 FMD的危害
  • 1.1.2 FMD的分布与流行
  • 1.1.3 FMD流行病学特征
  • 1.2 无FMD状态
  • 1.3 FMDV分子生物学研究进展
  • 1.3.1 基因组基本结构
  • 1.3.2 FMDV衣壳的装配
  • 1.3.3 病毒粒子抗原结构
  • 1.3.4 FMDV细胞受体研究
  • 1.4 FMDV的致病性与免疫机制
  • 1.4.1 FMDV的致病性
  • 1.4.2 免疫机制
  • 1.5 口蹄疫疫苗的研究进展
  • 1.5.1 FMDV传统疫苗
  • 1.5.2 FMDV新型疫苗
  • 1.5.3 FMDV新型疫苗的研究探讨
  • 第2章 研究目的与意义
  • 第3章 材料与方法
  • 3.1 试验材料
  • 3.1.1 毒株与细胞
  • 3.1.2 菌种与质粒
  • 3.1.3 主要药品及试剂
  • 3.1.4 培养基与抗生素及其配制
  • 3.1.5 血清
  • 3.1.6 缓冲液
  • 3.1.7 实验动物
  • 3.2 实验方法
  • 3.2.1 限制性内切酶酶切反应
  • 3.2.2 PCR产物或酶切产物的电泳检测
  • 3.2.3 PCR产物或酶切产物回收与纯化
  • 3.2.4 外源DNA片段与质粒载体的连接反应
  • 3.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
  • 3.2.6 连接产物的转化
  • 3.2.7 质粒的制备与鉴定
  • 3.2.8 伪狂犬病毒（PRV）基因组DNA的提取
  • 3.2.9 脂质体共转染法
  • 3.2.10 重组病毒的蚀斑纯化
  • 3.2.11 PCR检测目的外源基因在重组病毒中的整合
  • 3.2.12 Southern blot印迹分析
  • 3.2.13 质粒转染（脂质体介导转染法）
  • 3.2.14 构建重组杆状病毒的操作流程及示意图
  • 3.2.15 重组穿梭载体（Bacmid）的构建
  • 3.2.16 重组穿梭载体（Bacmid）的提取
  • 3.2.17 重组杆状病毒获得
  • 3.2.18 重组杆状病毒转导PK-15细胞
  • 3.2.19 猪外周全血培养及诱导
  • 3.2.20 间接免疫荧光试验（IFA）检测目的蛋白的体外表达
  • 3.2.21 Western blotting检测目的蛋白在真核细胞中的表达
  • 3.2.22 P1-ELISA试验
  • 50)的测定'>3.2.23 半数细胞培养物感染量(TCID50)的测定
  • 3.2.24 微量中和试验（固定病毒-稀释血清法）
  • 3.2.25 细胞免疫的检测
  • 3.2.26 动物试验
  • 3.2.27 统计学方法
  • 第4章 结果与分析
  • 4.1 FMDV重组PRV多价基因工程疫苗的构建和免疫效果研究
  • 4.1.1 转移质粒pIEFHG的构建
  • 4.1.2 重组病毒的构建与纯化
  • 4.1.3 重组病毒的Southern杂交鉴定
  • 4.1.4 重组病毒的Western杂交鉴定
  • 4.1.5 外源基因的多点同时插入对重组病毒在细胞上增殖的影响
  • 4.1.6 重组病毒免疫仔猪诱发抗PRV中和抗体的检测
  • 4.1.7 重组病毒免疫仔猪诱发抗PRV ELISA抗体的检测
  • 4.1.8 重组病毒免疫仔猪诱发抗FMDV中和抗体的检测
  • 4.1.9 重组病毒免疫仔猪诱发特异性针对FMDV淋巴细胞增殖水平检测
  • 4.2 O型FMDV"自杀性"DNA疫苗的构建和免疫效果的研究
  • 4.2.1 形成FMDV空衣壳的多基因片段的克隆与序列分析
  • 4.2.2 FMDV空衣壳真核表达质粒pceCAP的构建
  • 4.2.3 "自杀性"DNA疫苗pSCAI-eCAP的构建
  • 4.2.4 FMDV空衣壳体外表达检测
  • 4.2.5 免疫小鼠的中和抗体水平检测
  • 4.2.6 免疫小鼠的ELISA抗体水平检测
  • 4.2.7 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析
  • 4.2.8 病毒血症试验
  • 4.3 杆状病毒介导的FMDV空衣壳的表达及小鼠免疫试验
  • 4.3.1 转移载体pFast-eCAP的构建
  • 4.3.2 转移载体pFast-VSVG-CMV-eCAP的构建
  • 4.3.3 重组穿梭载体的构建
  • 4.3.4 重组杆状病毒的获得
  • 4.3.5 重组杆状病毒Ac-eCAP的体外表达检测
  • 4.3.6 重组杆状病毒Ac-V-eCAP转导哺乳动物细胞
  • 4.3.7 重组杆状病毒Ac-V-eCAP的纯化与毒价测定
  • 4.3.8 免疫小鼠的中和抗体水平
  • 4.3.9 免疫小鼠的ELISA抗体水平
  • 4.3.10 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析
  • 4.3.11 病毒血症试验
  • 4.4 猪源髓细胞分化因子MyD88作为分子佐剂对FMDV DNA疫苗免疫效力影响的研究
  • 4.4.1 猪源髓细胞分化因子MyD88的克隆与序列分析
  • 4.4.2 猪源髓细胞分化因子MyD88的分子建模
  • 4.4.3 真核表达MyD88质粒pcMyD88的构建
  • 4.4.4 MyD88体外表达检测
  • 4.4.5 MyD88与FMDV空衣壳共表达质粒pcMyD88-eCAP的构建
  • 4.4.6 免疫小鼠的中和抗体水平
  • 4.4.7 免疫小鼠的ELISA抗体水平
  • 4.4.8 免疫小鼠脾细胞分泌的IFN-γ水平分析
  • 4.4.9 病毒血症试验
  • 第5章 讨论与总结
  • 5.1 讨论
  • 5.1.1 FMDV的抗原表位分布及免疫原性
  • 5.1.2 伪狂犬病毒载体
  • 5.1.3 共转染与噬斑纯化
  • 5.1.4 多点同时插入外源基因对伪狂犬病毒增殖和毒力的影响
  • 5.1.5 外源基因在重组病毒中的表达
  • 5.1.6 重组病毒诱导的免疫反应
  • 5.1.7 病毒样颗粒疫苗的应用前景
  • 5.1.8 FMDV病毒样颗粒的形成
  • 5.1.9 表达FMDV病毒样颗粒的"自杀性"DNA疫苗的构建和免疫原性研究
  • 5.1.10 VSV-G修饰的重组杆状病毒的构建
  • 5.1.11 重组杆状病毒诱导的免疫应答
  • 5.1.12 cross-over PCR方法在猪源髓细胞分化因子MyD88克隆中的应用
  • 5.1.13 猪源髓细胞分化因子MyD88作为分子佐剂对FMDV DNA疫苗免疫效果的影响
  • 5.2 结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录

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