论文摘要
目的:构建人乳头瘤病毒18型（HPV 18）E2蛋白N端结构域（TAD）和C端结构域（DBD）与绿色荧光蛋白（EGFP）融合蛋白真核表达载体pEGFP-C1/TAD和pEGFP-C1/DBD,将其与pEGFP-C1/E2及pEGFP-C1分别转染THP-1巨噬细胞（macrophage, MΦ）,分析各组培养基上清中TNF-α和IL-1β的含量以及MΦ凋亡率,为进一步研究E2蛋白在HPV 18致癌机制中的作用提供一定的实验依据。方法:（1）用Primer5.0引物设计软件设计引物,聚合酶链反应（PCR）扩增E2蛋白N端和C端基因。将PCR产物纯化后与pEGFP-C1载体连接,转化E.coli JM109并提取质粒,经酶切和测序鉴定,筛选阳性克隆。（2）将质粒pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD、pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1分别为4组,即GFP-TAD组、GFP-DBD组、GFP-E2组、GFP组;每组质粒0.5μg/ml分别转染MΦ,并设空白对照组（Control）。转染48 h后,利用Western-blot和荧光显微镜检测它们的表达与定位。（3） ELISA检测各组细胞培养基上清中TNF-α和IL-1β的含量,RT-PCR检测其mRNA表达;收集MΦ,利用染色法和流式细胞术（FCM）观察检测MΦ凋亡。通过统计软件SPSS13.0对实验数据进行统计分析。结果:（1） PCR产物连接至pEGFP-C1载体上后,双酶切及测序结果表明目的片段与HPV18 E2基因TAD、DBD序列完全一致。所构建的真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD以及pEGFP-C1/E2、pEGFP-C1分别转染THP-1 MΦ48 h后,GFP-DBD融合蛋白定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆,GFP-E2、GFP在细胞核、浆内均有表达,但GFP-E2表达组细胞核荧光亮度强于细胞胞浆,GFP在细胞核浆内呈均匀表达。Western-blot结果显示,在THP-1 MΦ中表达分子量分别约为29.4 kD、53.4 kD、70.7 kD、38.6 kD的条带,与预期GFP、GFP-TAD、GFP-E2、GFP-DBD大小一致。（2）转染THP-1 MΦ48 h后,GFP-E2、GFP-TAD组培养上清中TNF-α、IL-1β的含量明显高于Control组（P<0.001）,且两组之间TNF-α浓度存在统计学差异（P<0.05）;GFP-TAD组IL-1β含量略高于GFP- E2组,但差异无显著性（P>0.05）;而GFP- DBD、GFP组TNF-α及IL-1β含量与对照组比较,无统计学差异（P>0.05）。TNF-α和IL-1βmRNA的表达量与上清液中TNF-α和IL-1β含量一致。（3） GFP-E2、GFP-TAD组MΦ凋亡率明显高于Control组（P<0.001）,且GFP-TAD组MΦ凋亡率高于GFP-E2组（P<0.05）;但GFP-DBD、GFP组与Control组比较,MΦ凋亡率无统计学差异（P>0.05）。结论:（1）成功地扩增了HPV18 E2TAD和DBD基因,构建了真核表达载体pEGFP-C1/TAD、pEGFP-C1/DBD,且其与质粒pEGFP-C1/E2和pEGFP-C1均能在THP-1 MΦ中表达,GFP-DBD融合蛋白定位于细胞核内,GFP-TAD定位于细胞浆。（2） HPV18 E2及其TAD与GFP融合蛋白瞬时高表达上调THP-1 MΦ分泌TNF-α和IL-1β。（3） HPV18 E2及其TAD与GFP融合蛋白瞬时高表达诱导THP-1 MΦ凋亡。