辽东楤木三萜皂苷合成相关基因克隆及功能研究

论文摘要

辽东楤木（Aralia elata （Miq.） Seem）,系五加科楤木属落叶小乔木。传统中草药,入药部位是根皮、茎皮、叶及嫩芽,具有补气安神、强精滋肾、祛风活血、除湿止痛等功效,用于治疗神经衰弱、风湿性关节炎和恶性肿瘤等症。最新研究表明：辽东楤木茎、叶具有较强的抗肝损伤作用,而且已经研制、开发出治疗肝炎的新药。辽东楤木主要入药成分是齐墩果烷型三萜皂苷,而且含量较高。齐墩果烷型三萜皂苷的生物合成途径已经明确,法呢基焦磷酸合成酶（FPS）和β-香树素合成酶（β-AS）是本合成途径的两个关键酶。本研究旨在利用生物技术手段从辽东楤木中分离FPS和β-AS两个关键酶基因,利用转基因技术转入大肠杆菌和酵母中实现异源表达。目标是从转目的基因的微生物中获得抗肝炎药物齐墩果酸,从而解决临床上对齐墩果酸的大量需求。本研究利用RT-PCR技术,首次在辽东楤木中克隆到法呢基焦磷酸合酶基因（FPS）和β-香树素合成酶基因（β-AS）,GenBank的登录号分别是HM219226和HM219225,并对FPS和β-AS进行结构分析和功能验证。法呢基焦磷酸合成酶（FPS:EC2.5.1.1/EC2.5.1.10）位于三萜皂苷生物合成途径中游,催化五碳原子的异戊烯基焦磷酸（IPP）和二甲丙烯基焦磷酸（DMAPP）以“头-尾”连续缩合,形成15碳的法呢基焦磷酸（FPP）。FPS基因cDNA全长1040bp,其中包括1029bp完整的开放阅读框（Open Reading Frame, ORF）,推测编码342个氨基酸,通过DNAMAN与人参、三七等氨基酸序列比对发现,同源性达到80%以上。同时构建原核表达载体pET-28a-FPS,进行原核表达分析,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,诱导得到39.6kD的融合蛋白,由此表明FPS基因在E.coli BL21中获得成功表达。β-香树素合成酶（β-AS:EC5.4.99.B1）的作用位点在三萜皂苷生物合成途径的下游,将2,3-氧化鲨烯催化合成五环三萜类骨架β-香树素。此酶属于氧化鲨烯环化酶（OSC）家族。β-AS基因cDNA全长2292bp,其中包括2292bp完整的ORF,推测编码763个氨基酸,通过DNAMAN与人参、苜蓿、青蒿等氨基酸序列比对,同源性达到70%以上。同时构建原核表达载体pET-28a-AS,进行原核表达分析,SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,诱导得到87.8kD的融合蛋白,由此表明β-AS基因在E.coli BL21中获得成功表达。将β-AS基因转入到Pichia pastoris中,进行基因功能验证。构建酵母表达载体pPIC9k-AS,表达产物经SDS-PAGE和Western blot检测得到87.8kD的诱导蛋白,说明β-AS基因在酵母中成功表达。应用HPLC技术,对转β-AS基因酵母的代谢目标产物鉴定检测,结果显示,β-AS在酵母中不但表达且具有活性,能够催化2.3-氧化鲨烯生成β-香树素。本研究利用Real-time PCR技术分析了辽东楤木法呢基焦磷酸合酶和p-香树素合酶基因在侧根、茎、叶和花器官中的表达差异。两个关键酶基因在茎、叶、花、侧根中均有表达,其中茎中的相对表达量最高,侧根中最低。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 辽东楤木研究进展
• 1.1.1 辽东楤木植物资源学的研究
• 1.1.2. 辽东楤木植物化学成分的研究
• 1.1.3 辽东楤木药理学的研究
• 1.1.4 辽东楤木生物技术的研究
• 1.2 利用生物工程生产次生代谢产物的研究进展
• 1.2.1 植物次生代谢产物
• 1.2.2 药用植物有效成分的细胞生产
• 1.2.3 毛状根生产药用植物有效成分
• 1.2.4 酵母生产次生代谢产物
• 1.3 三萜皂苷生物合成途径限速酶研究进展
• 1.3.1 三萜皂苷及其合成途径
• 1.3.2 法呢基焦磷酸合成酶基因（FPS）研究进展
• 1.3.3 β-香树脂合成酶基因（β-AS）研究进展
• 第2章 辽东楤木法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆及原核表达
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和克隆载体
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 实验所需试剂及培养基的配制
• 2.1.5 主要仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 辽东楤木法呢基焦磷酸合成酶基因的克隆
• 2.2.2 FPS原核表达
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 AeFPS基因的克隆与序列分析
• 2.3.2 辽东楤木FPS原核表达
• 2.4 讨论
• 第3章 辽东楤木B-香树素合成酶基因的克隆及原核表达
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株和克隆载体
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 实验所需试剂及培养基的配制
• 3.1.5 主要仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 辽东楤木β-AS基因的克隆
• 3.2.2 β-AS基因的原核表达
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 β-AS基因的克隆与序列分析
• 3.3.2 辽东楤木β-AS原核表达
• 3.4 讨论
• 第4章 辽东楤木三萜合成相关基因的表达分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂盒及购买的试剂
• 4.1.3 仪器和设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 各组织器官的RNA提取
• 4.2.2 各组织器官的cDNA合成
• 4.2.3 特异引物的设计和合成
• 4.2.4 荧光定量PCR
• 4.2.5 计算方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 辽东楤木根、茎、叶、花总RNA的提取
• 4.3.2 cDNA的合成
• 4.3.3 PCR鉴定
• 4.3.4 样品特异扩增的产物确定
• 4.3.5 不同组织样品GAPDH、FPS和β-AS基因的扩增结果
• 4.3.6 定量结果的数据统计
• 4.4 讨论
• 4.4.1 实时荧光定量PCR技术
• 4.4.2 内参基因的选择
• 4.4.3 引物的设计
• 4.4.4 材料的选择
• 4.4.5 分析结果
• 第5章 B-香树素合成酶基因在真核生物酵母中的表达
• 5.1 材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 试剂
• 5.1.3 主要试剂的配制
• 5.1.4 实验器材
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 目的基因的扩增
• 5.2.2 酵母重组子表达载体的构建
• 5.2.3 酵母转化子的PCR鉴定
• 5.2.4 外源基因表达蛋白的SDS-PAGE和Western blot印迹检测
• 5.2.5 目标代谢产物β-香树素的HPLC测定
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 重组质粒pGM-T-AS的构建与鉴定
• 5.3.2 目的基因酵母表达载体的构建
• 5.3.3 酵母转化子pPIC9K-AS的分子检测
• 5.3.4 目标蛋白的SDS-PAGE分析及Western blot检测
• 5.3.5 酵母转化子的目标代谢产物的测定
• 5.4 讨论
• 5.4.1 选择毕赤酵母生产次生代谢产物
• 5.4.2 分步酶切的选择
• 5.4.3 HPLC标准品的选择
• 第6章 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文和研究成果
• 致谢