太湖猪成纤维细胞系和前脂肪细胞系的建立及前脂肪细胞的分化研究

论文摘要

本实验以太湖猪为研究对象,采用组织块法培养成纤维细胞系,胶原蛋白酶消化法培养前脂肪细胞系,并对所建细胞系进行了鉴定,包括细胞形态观察、冻存前和复苏后接种的存活率测定、生长曲线绘制、染色体核型分析等一系列的生物学特性分析。此外,采用50nmol/L胰岛素、100 nmol/L地塞米松、100 nmol/L罗格列酮和0.25 mmol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤分化诱导已建立的前脂肪细胞,观察其形态学变化,用油红O染色法进行定性检测,并通过测定OD值确定诱导过程中细胞甘油三酯的变化情况。得到结果如下:1.成纤维细胞呈梭形或不规则三角形,细胞先沿组织块周围生长,随后向外伸展形成生长晕,传代细胞与原代细胞在形态上无明显差异。前脂肪细胞接种3～6h后开始贴壁,为典型的成纤维细胞样。2.成纤维细胞冻存前和复苏后接种的存活率分别为96.5%和93.2%,前脂肪细胞分别为95.4%和92.3%。3.成纤维细胞和前脂肪细胞的群体倍增时间均为72h,在体外的生长增殖趋势呈“S”型,经历了潜伏期、指数增生期和停滞期三个阶段,符合细胞在体外生长的一般规律。4.对成纤维细胞和前脂肪细胞进行染色体分析得出:2n=38,XY,为稳定的二倍体细胞系,不存在种间的交叉污染。5.诱导分化过程中,第3d即可观察到小脂滴,第4d有多个小脂滴,随着分化进行大多数胞浆中的小脂滴聚集成葡萄串状,细胞变成椭圆形或者圆形。大部分前脂肪细胞在第9～10d均成功的分化成为成熟的脂肪细胞,用油红O染色呈红色。6.细胞内脂肪含量测定与分化过程中细胞形态变化情况吻合。综上所述,以上各项指标都符合细胞建系的要求,成功的构建出了太湖猪的成纤维细胞系和前脂肪细胞系,并诱导分化出成熟的脂肪细胞。

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第一章文献综述

1. 太湖猪及其遗传资源保护

1.1 太湖猪品种概况

1.1.1 太湖猪的分布

1.1.2 太湖猪的体型外貌

1.1.3 太湖猪的品种特性

1.2 太湖猪的研究和利用状况

1.2.1 国外对太湖猪的研究和利用

1.2.2 国内对太湖猪的研究和利用

1.3 太湖猪遗传资源保护的现状

1.4 遗传资源保护的方法

2. 细胞系的建立及其在畜禽遗传资源保护中的应用前景

2.1 细胞系的建立

2.1.1 体外细胞培养体系

2.1.2 细胞系建立的方法

2.1.3 畜禽体细胞系的生物学检测

2.4 细胞系用于畜禽遗传资源保存

2.4.1 细胞系用于畜禽遗传资源保存的可能性

2.4.2 体细胞克隆存在的问题

3. 猪前脂肪细胞分化的研究

3.1 猪前脂肪细胞分化研究的意义

3.1.1 用作动物模型

3.1.2 用于猪的遗传育种研究

3.2 前脂肪细胞分化的研究进展

3.2.1 前脂肪细胞的体外培养系统

3.2.2 前脂肪细胞分化的过程

3.2.3 前脂肪细胞分化的影响因素

3.2.4 前脂肪细胞分化的标志

3.2.5 前脂肪细胞分化程度的鉴定

3.3 猪前脂肪细胞的研究进展

4. 目的和意义

4.1 太湖猪成纤维细胞系和前脂肪细胞系的建立

4.2 太湖猪前脂肪细胞分化的研究

第二章太湖猪细胞系的建立

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 成纤维细胞的原代培养

1.2.2 前脂肪细胞的原代培养

1.2.3 细胞的传代培养

1.2.4 细胞的观察

1.2.5 细胞的冻存

1.2.6 细胞的复苏

1.2.7 细胞系冻存前和复苏后的存活率测定

1.2.8 细胞系生长曲线的绘制

1.2.9 细胞系染色体标本的制备

2. 结果与分析

2.1 细胞形态学观察

2.2 细胞系冻存前和复苏后存活率的测定

2.3 细胞系生长曲线的绘制

2.4 细胞系的核型分析

3. 讨论

3.1 细胞培养

3.1.1 细胞原代培养方法的选择

3.1.2 微生物污染

3.1.3 传代培养

3.2 细胞冻存

3.3 生长动力学

3.4 前脂肪细胞系的鉴定

3.5 前脂肪细胞的自主分化

第三章前脂肪细胞的分化研究

1. 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 前脂肪细胞的分化诱导

1.2.2 油红O染色

1.2.3 油红O染色提取法测OD值

2. 结果与分析

2.1 前脂肪细胞分化过程中的形态学观察

2.2 油红O染色

2.3 油红O染色提取法测OD值

3. 讨论

第四章结论

1. 建立了太湖猪成纤维细胞系和前脂肪细胞系

2. 成功诱导太湖猪前脂肪细胞的分化

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的学术论文

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