B7-H4分子的抗体制备及其在肿瘤研究中的应用

论文摘要

背景:B7-H4,又称B7S1或B7x,是共刺激分子B7家族的最新成员,为Ⅰ型跨膜糖蛋白,编码282个氨基酸。由美国Mayo医学中心于2003年发现,是B7家族相关的第3个T细胞抗原特异性反应的负性调控分子。人B7-H4的cDNA长约1.8Kb,位于人的染色体1p11.1,在基因组上跨越66Kbp。B7-H4的mRNA在淋巴和非淋巴组织中都有表达,但免疫组化显示,B7-H4蛋白仅在部分正常组织中微弱的表达。B7-H4可以在活化的人T细胞、B细胞、巨噬细胞、DC细胞上呈诱导性表达。业已发现,一些肿瘤细胞也呈组成性表达B7-H4,如乳腺癌、卵巢癌和肺癌等。对小鼠组织的Northern Blot实验发现,根据组织类型的不同,小鼠的B7-H4共有四种不同的mRNA剪切形式。RT-PCR分析显示,人类的组织至少拥有两个转录本。研究表明,正常外周组织能在翻译水平对B7-H4的表达进行严密的调控。在机体的免疫应答过程中,B7-H4作为重要的共刺激分子,在CD4+、CD8+T细胞的分化发育、细胞周期进展以及细胞因子的产生等方面发挥广泛的抑制效应。B7-H4对外周组织的细胞免疫应答起着负性调节的作用,且由于其特异性表达于某些肿瘤细胞表面,因而可能在机体的肿瘤免疫逃避机制中起着重要作用。因此,B7-H4分子途径为肿瘤、自身免疫性疾病和抗病毒及移植排斥反应等疾病提供了新的治疗思路。阻断B7-H4与其受体的相互作用,有望成为干预自身免疫性疾病和肿瘤生物治疗的潜在靶点。目的:为了更深入研究B7-H4与肿瘤免疫的关系,本实验设计并合成了人B7-H4多肽,应用该多肽制备了兔抗人B7-H4多克隆抗体,并应用该抗体研究B7-H4分子在多种肿瘤细胞和肿瘤组织中的表达,并探讨其意义。方法:1.根据GenBank公布的序列（AAP37283）,利用计算机辅助设计,确定并人工合成B7-H4抗原多肽,并用Keyhole Limpet Hemocyanin（KLH）交联以增强B7-H4抗原多肽的免疫原性。将交联KLH的B7-H4抗原肽免疫新西兰兔（经初次免疫和四次加强免疫）后获取免疫兔血清,亲和纯化法纯化兔血清中的抗B7-H4抗体。采用直接ELISA法、Western-blot免疫印迹鉴定抗B7-H4抗体的效价、反应的特异性和敏感性;2.免疫组织化学染色检测组织芯片上多种肿瘤组织中人B7-H4蛋白的表达情况;3.根据GenBank公布的序列（NM024626）,合成了h B7-H4的PCR引物,应用RT-PCR检测多种肿瘤细胞株中人B7-H4mRNA的表达;4.Western-Blot检测多种肿瘤细胞株中人B7-H4蛋白的表达。结果:1.成功制备了兔抗人B7-H4多克隆抗体;2.免疫组化检测结果显示肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌及肾癌等多种肿瘤组织的细胞膜和细胞浆均有B7-H4蛋白的阳性染色,而在各种对照的正常组织中仅表达为阴性至弱阳性;3.RT-PCR结果显示8种肿瘤细胞株在目的条带1200bp左右处均有B7-H4mRNA的表达;4.Western-Blot检测9种细胞株中B7-H4蛋白的表达,结果显示A549、MCF-7、SK-BR-3、CaoV3、SK-OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等肿瘤细胞株均表达B7-H4蛋白,而A293细胞株未检测到B7-H4蛋白表达。结论:1.成功制备了兔抗人B7-H4多克隆抗体;2.肺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌及肾癌等多种肿瘤组织的细胞膜和细胞浆均有B7-H4蛋白的阳性染色;3.A549、MCF-7、SK-BR-3、CaoV3、SK-OV-3、SiHa、HeLa、HepG2等肿瘤细胞株均有B7-H4mRNA和B7-H4蛋白的表达;

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 缩写
• 目次
• 引言
• 第一部分 兔抗人B7-H4多克隆抗体的制备
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 第二部分 兔抗人B7-H4多克隆抗体在肿瘤研究中的应用
• 实验一 免疫组化检测B7-H4蛋白在多种肿瘤组织的表达
• 实验二 RT-PCR检测多种肿瘤细胞株中B7-H4 mRNA的表达
• 实验三 Western-blot检测B7-H4蛋白在多种肿瘤细胞株中的表达
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录 组织芯片结果
• 附录 综述
• 参考文献
• 作者简历