除虫菊花均一化cDNA文库的构建及EST序列分析

论文摘要

除虫菊（Chrysanthemum Cinerariifolium）是菊科多年生草本植物,是目前世界上唯一集约化种植的杀虫植物。除虫菊的杀虫活性物除虫菊素（pyrethrins）具有高效、低毒、广谱、低残留等优良杀虫特性,对人、温血动物和环境没有危害,已成为当今无公害生物杀虫剂的重要研究热点之一。除虫菊素主要在除虫菊花中合成,其含量占整个植株的95%以上,而干花中除虫菊素含量在1.2-2.0%。目前,天然除虫菊素已广泛应用在农业、林业、生物农药和食品卫生安全等多个领域。但国内外对于天然除虫菊素合成相关基因的研究很少,从而制约了利用基因工程技术提高除虫菊花中除虫菊素的含量。构建除虫菊花cDNA文库,可以为今后除虫菊素合成相关基因的研究奠定基础。本研究以除虫菊花为实验材料,经均一化处理,构建了除虫菊花的均一化cDNA文库,随机挑选部分克隆进行EST测序后,进行同源性比较和基因功能分析,得到以下结论:1采用试剂盒柱离心法提取除虫菊花的总RNA,经过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测,提取的除虫菊花总RNA有清晰的两条带28S与18S,而且两条带清晰锐利,没有拖尾,说明提取总RNA完整,没有降解。以总RNA为模板,利用SMARTⅣOligonuleotide和CDS-3M adapter为引物,在PowerScript Reverse Transcriptase作用下合成第一链cDNA并且进一步合成双链cDNA,用均一化酶DSN、限制性内切酶sfi I处理后,凝胶回收400 bp以上的片段,浓缩后与载体pDNR-LIB载体连接,电转化转入大肠杆菌,获得除虫菊花cDNA原始文库。原始文库经扩增后,所得扩增文库置于-80℃超低温冰箱中保存。2将得到的原始文库按比例稀释后铺平板并于37℃下过夜培养,计算单菌落数。得出原始文库滴度为2.8×105 pfu/mL,重组率为96%。利用载体的M13引物进行PCR扩增,得到该文库的大部分插入片段大小在0.4-1.3 kb。采用相同的方法测定cDNA扩增文库的滴度约为2.0×109pfu/mL。3从文库中随机挑取部分克隆,经PCR检测都有外源插入片段。对65个阳性克隆采用T7作为测序引物,从cDNA5’端进行测序,得到61个EST序列,经过比较拼接后有3条序列分别是由2个EST拼接而成,最终得到有效序列58个。4通过BLASTX与NCBI的GeneBank数据库中现有的ESTs进行同源性分析表明,所得的58个ESTs序列中有48（82.3%）个具有同源序列,其中40个序列有明确的功能注释,8个为未知功能基因,有10个（17.2%）ESTs序列未找到同源序列。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 绪论
• 1.1 除虫菊概述
• 1.2 均一化CDNA 文库
• 1.2.1 均一化方法
• 1.2.2 均一化文库的构建方法
• 1.3 EST 技术简介
• 1.3.1 表达序列标签（EST）的概念
• 1.3.2 EST 的应用
• 1.3.3 EST 的不足之处
• 1.4 研究目的及技术路线
• 1.4.1 研究目的
• 1.4.2 技术路线
• 2 除虫菊花均一化CDNA 文库的构建
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 植物材料
• 2.2.2 菌株
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 引物序列
• 2.2.5 培养基
• 2.2.6 主要仪器设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 除虫菊花的采集与处理
• 2.3.2 除虫菊花总RNA 的提取
• 2.3.3 第一链cDNA 合成
• 2.3.4 cDNA 双链扩增
• 2.3.5 杂交反应
• 2.3.6 DSN 处理
• 2.3.7 均一化后cDNA 扩增
• 2.3.8 SfiⅠ酶切cDNA
• 2.3.9 凝胶回收所需的cDNA 片断
• 2.3.10 均一化cDNA 与pDNR-LIB 载体连接
• 2.3.11 电转化感受态细胞的制备
• 2.3.12 电转化大肠杆菌
• 2.3.13 原始文库滴度的测定
• 2.3.14 文库插入片段及重组率的检测
• 2.3.15 文库的扩增与扩增后滴度的测定
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 除虫菊花总RNA 的提取
• 2.4.2 双链cDNA 的合成
• 2.4.3 均一化结果
• 2.4.4 文库的滴度检测
• 2.4.5 文库重组率和插入片段长度的检测
• 2.5 讨论
• 2.5.1 除虫菊花总RNA 的提取
• 2.5.2 双链cDNA 的合成
• 2.5.3 均一化处理
• 2.5.4 分级分离及连接
• 3 EST 序列测定与分析
• 3.1 引言
• 3.2 材料与仪器
• 3.2.1 除虫菊花cDNA 文库
• 3.2.2 试剂和引物
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 独立克隆的获得
• 3.3.2 EST 序列初步处理
• 3.3.3 EST 序列相似性比较
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 测序结果分析
• 3.4.2 EST 序列相似性比较分析
• 3.4.3 序列的生物学功能分类
• 3.5 讨论
• 4 结论与展望
• 4.1 主要结论
• 4.2 后续工作展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录