乙型肝炎病毒DNA在人卵母细胞和胚胎中的整合及HBV感染妇女ART结局的研究

论文摘要

背景：乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）是一种引起乙型肝炎（hepatitiS B）的嗜肝性病毒。全球有20多亿人有乙型肝炎病毒感染史,其中约有3.5亿人为HBV的慢性携带者,HBV的感染与80%的原发性肝细胞癌具有相关性,每年约有100多万人死于因HBV感染引起的严重肝脏疾病。我国是乙型肝炎高发区,1-60岁人群中HBsAg阳性率为7.2%,其中处在婚育年龄人群乙肝病毒携带率近10%。乙型肝炎病毒广泛存在于乙肝患者的体液中,如唾液、泪液、汗液、乳汁、精液、内分泌液和血液。血清HBeAg、HBV-DNA和Pre-S1均是反应乙肝病毒复制或传染性的重要指标,在HBV感染早期,具有较高的一致检出率,然而HBVDNA是复制活动最直接和可靠的指标。传播渠道多样化：输血、性交、医源性及密切的生活接触等水平传播和父婴、母婴之间的垂直传播（vertical transmission）.垂直传播是HBV传播的主要途径之一,其可分为母婴传播和父婴传播。母婴垂直传播可分为3个水平：产前传播、产时传播及产后传播。产前传播可分为经胎盘传播（transplacental transmission）和经生殖细胞（generative cells）传播。近年来,经过适当的主动、被动联合免疫干预,能够有效阻断多数HBV的感染,但仍然有约10%的婴儿阻断失败。研究发现在人类生殖腺及生殖细胞如睾丸、精子、精浆以及卵巢中的颗粒细胞、卵细胞中有HBV的存在和表达,从而使得乙型肝炎病毒经生殖细胞进行垂直传播的学说得以发展。乙型肝炎病毒亦可影响人类生殖能力。HBV感染可以通过全身或局部的免疫作用、病毒基因的整合干扰基因组正常机能以及肝炎病毒蛋白表达影响精子的产生、导致形态和活力的改变,从而降低人类生殖能力。随着人类辅助生殖技术日益进步、人类生活模式变化以及环境的影响,越来越多的人接受辅助生殖技术助孕治疗,其中不乏有乙型肝炎携带不孕夫妇。在这一领域中,病毒感染影响辅助生殖技术治疗结局的问题引起人们的关注。然而,HBV感染是否降低辅助生殖治疗的结局?目前尚未有一致的观点。本课题拟研究乙型肝炎病毒携带患者血清和卵泡液中病毒载量的关系；体内病毒复制状态与发生经卵母细胞垂直传播的关系；女性乙肝病毒携带者血清和卵泡液中病毒含量与辅助生殖治疗结局的关系,为临床对HBV携带患者开展ART治疗提供理论依据。材料与方法：收集2009年2月～2009年12月在浙江大学附属妇产科医院生殖内分泌科接受常规体外受精/卵胞浆单精子注射-胚胎移植治疗的176例乙肝病毒携带妇女的血清和卵泡液；176例中的106例乙肝病毒携带妇女废弃的卵母细胞206个及胚胎441个。采用荧光定量PCR方法检测血清与卵母细胞的HBV DNA浓度,用HBV DNA全长作为探针采用原位杂交方法（Fluorescence in situ hybridization, FISH）检测HBV DNA在胚胎和卵母细胞中的整合。通过统计软件分析血清和卵泡液中病毒载量与发生HBV DNA在卵母细胞和胚胎中整合的关系。同时选择2006年01月-2009年12月在本中心接受体外受精助孕治疗的513对女性乙肝病毒携带不孕夫妇的557个周期作为暴露组。以女方年龄（年龄±1）、取卵时间（天数±1）以及ART受精方式（IVF和ICSI）作为匹配条件,利用SPSS统计软件随机抽取1：1本院同年的,夫妇双方均为乙肝阴性周期作为非暴露组。两组建立回顾性队列,分析女方乙肝携带对于着床率（孕囊数/ET胚胎数）、临床妊娠率（超声证实为宫内孕妇女数／完成移植周期数）、流产率（发生流产妇女数／宫内孕妇女总数）,分娩数（完成分娩妇女数／完成胚胎移植周期数）以及周期得孩率（活产胎儿数/ART启动周期数）,同时分析女性体内病毒复制状态如HBeAg血清状态、血清病毒拷贝数及卵泡液中病毒含量对于ART结局的影响。结果：血清中HBV DNA阳性检出率为54.4%,卵泡液可检测到乙肝病毒DNA,阳性率为45.7%；多数血清中HBV DNA含量高于卵泡液（P<0.05）,然而少部分患者其卵泡液中病毒含量较血清中高。线性相关分析发现血清和卵泡液间乙肝病毒DNA含量存在中等强度正相关,（R=0.427,P=0.001）。卵母细胞内HBV DNA整合信号的阳性率为8.25%,早期胚胎内的阳性率为12.92%；HBeAg阳性组卵母细胞的HBV DNA阳性率显著高于HBeAg阴性组（14.8%VS 4.5%,P<0.05）,前者胚胎的阳性率较后者有增高趋势（17.1%VS 10.6%,P=0.051）；血清HBV DNA>106组胚胎及卵母细胞中HBV DNA整合的阳性率显著高于HBV DNA<106组（P<0.05）；卵泡液中HBV DNA≥105组胚胎及卵母细胞中HBV DNA整合的阳性率显著高于HBV DNA<105组（P<0.05）；着床率、临床妊娠率、以及周期得孩率阳性组较阴性对照组稍低而流产率稍增加,但未达到统计学差异（P>0.05）,活胎分娩周期在阳性组中显著低于对照组（P<0.05）; HBV DNA>105病人流产率比HBV DNA<105组显著性增加,周期得孩率显著性降低（P<0.05）；卵泡液HBV DNA阳性组的着床率、临床妊娠率、活胎分娩周期以及周期得孩率较阴性组显著性降低（P<0.05）。结论：1、乙型肝炎病毒携带患者卵泡液中存在乙肝病毒的复制；2、进一步验证乙肝病毒DNA可整合到人卵母细胞和胚胎中；3、卵泡液中的HBV DNA含量多数较血清中低,两者存在中等程度的正相关；4、血清中HBeAg阳性病毒在卵母细胞中的整合率显著增高；5、血清HBV DNA>1.0×106拷贝/毫升,卵跑液中HBV DNA浓度≥1.0×105拷贝/毫升时病毒在卵母细胞及胚胎中的整合率显著增高；6、乙肝携带状态对妇女卵巢储备能力以及卵巢对促排卵治疗的反应性无影响；7、女方乙肝携带夫妇经体外受精胚胎移植治疗后最终获得活胎分娩的周期较阴性对照组有显著性降低；8、女方血清HBV DNA>1.O×105拷贝/毫升夫妇经体外受精胚胎移植治疗后流产率显著增加,周期得孩率明显降低（P<0.05）；9、卵泡液中HBV DNA阳性患者接受体外受精胚胎移植治疗后胚胎着床率、临床妊娠率显著降低,活胎分娩周期、周期得孩率均显著降低。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• Abstracts
• 主要缩略语中英文对照表
• 目次
• 引言
• 第一部分:血清和卵泡液中HBV载量及人卵母细胞和胚胎中HBV DNA的检测
• 资料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 第二部分:乙肝病毒感染妇女ART结局的研究
• 资料和方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 作者简历及在学期间发表的文章