sigE、sigK和spoⅢAE对苏云金芽胞杆菌cry基因表达的影响

论文摘要

苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。Bt与其它芽胞杆菌相比,一个显著特点就是不仅能够形成芽胞,同时还能产生由杀虫蛋白组成的晶体。在模式芽胞杆菌—枯草杆菌中有关芽胞形成的相关基因研究较深入,Bt晶体形成机制方面的研究主要集中在杀虫晶体蛋白基因的表达调控,而晶体形成又与芽胞形成特异性基因有关。在芽胞杆菌的模式菌—枯草芽胞杆菌芽胞形成的级联调控网络中,SigE和SigK因子是芽胞杆菌芽胞形成过程中起重要作用的sigma因子,控制着众多芽胞形成相关基因的表达。在苏云金芽胞杆菌中,Cry1等杀虫晶体蛋白的表达也受SigE因子和SigK因子的控制。spoIIIAE基因的转录由上游的SigE因子控制,SpoIIIAE蛋白则是激活下游的SigK因子所必需的,研究表明spoⅢAE基因的缺失也影响芽胞晶体的形成。本研究的sigE和sigK部分主要以苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种标准菌株HD-73为材料,构建了sigE和sigK基因的敲除载体pMADE和pRNK,导入HD-73菌株,利用同源重组技术通过高温诱导分别敲除了其中的sigE和sigK基因,获得了sigE和sigK单基因缺失突变株HD-73 （△sigE）和HD-73 （△sigK）。研究结果表明:突变对菌株生长影响较大,衰亡期提前,丧失了形成芽胞和晶体的能力;以cry1Aa基因启动子表达β-半乳糖苷酶,酶活性显著降低,说明sigE和sigK基因对cry1Aa基因启动子活性具有较大影响。以sigE直接调控的spoⅡD基因启动子表达β-半乳糖苷酶,分析表明突变株中spoⅡD基因的活性菌显著降低。随后,以sigE所在操纵子spoIIG的启动子表达β-半乳糖苷酶,结果表明突变株HD-73 （△sigK）中sigE基因的转录水平显著降低。这说明sigK基因的敲除严重降低了SigE因子的活性。利用表达载体pHT315对突变株进行恢复,pHT315携带sigE所在操纵子spoIIG及其启动子序列在突变株HD-73 （△sigE）中表达,使突变株恢复了产生芽胞和形成杀虫晶体的能力,生长基本恢复正常。pHT315携带sigK及其启动子序列在突变株HD-73 （△sigK）中表达,没有能使该基因功能恢复,再导入另一种抗性的spoIIG表达载体后仍然没有得到能够产生芽胞和形成杀虫晶体的恢复株。这些结果表明在Bt库斯塔克亚种中,SigE和SigK因子是菌株产生芽胞和形成晶体所必需的,并且两者之间存在一种复杂的调控关系。spoⅢAE基因的缺失对sigE基因的转录水平影响的研究以苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种G03为材料。sigE启动子指导的β-半乳糖苷酶活性分析表明,突变株G03 （△spoⅢA E）中sigE基因的转录水平显著降低。这说明spoⅢAE基因的敲除严重降低了pre-SigE因子的转录。在枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis,简称Bs）168的spoⅢAE基因的缺失突变株中,spoⅡD和sigE的启动子指导的β-半乳糖苷酶活性均没有降低,这说明spoⅢAE基因的敲除没有影响pre-SigE因子的转录。这表明,在Bt和Bs中,spoⅢAE基因对pre-SigE因子转录的影响存在差异。sigE、sigK和spoⅢA E基因在芽胞杆菌芽胞形成过程中起着重要的作用,而其中sigE和sigK基因编码芽胞形成重要的调节因子SigE和SigK因子,两基因缺失突变株的获得为今后利用基因芯片表达谱分析技术、解析SigE和SigK因子调控的基因数目,揭示杀虫晶体蛋白的表达调控、晶体形成机制及其与芽胞形成的关系提供了必要的材料,具有重要的理论意义;并能够进一步揭示更多在Bt和Bs中表达存在差异的类似于spoⅢAE的基因。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 芽胞
• 1.1.1 芽胞形成的起始
• 1.1.2 细胞不对称分裂和前芽胞的形成
• 1.1.3 基因的区室化表达和芽胞内吞
• 1.1.4 芽胞的成熟
• 1.1.5 芽胞的萌发
• 1.2 BT 杀虫晶体蛋白
• 1.2.1 Bt 杀虫晶体蛋白基因
• 1.2.2 杀虫晶体蛋白基因的表达与调控
• 1.3 立题依据和目的意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 培养基与抗生素
• 2.1.3 引物名称及序列
• 2.1.4 酶与生化试剂
• 2.1.5 常用溶液与缓冲液
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 模板的制备
• 2.2.2 PCR 扩增
• 2.2.3 酶切反应
• 2.2.4 E.coli 质粒DNA 提取
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳
• 2.2.6 目的DNA 的回收
• 2.2.7 DNA 片段的连接
• 2.2.8 E.coli 热击感受态细胞的制备
• 2.2.9 质粒热击转化E.coli
• 2.2.10 PCR 扩增片断的克隆与序列分析
• 2.2.11 E.coli 电击感受态细胞的制备
• 2.2.12 E.coli 电击转化方法
• 2.2.13 Southern blotting 验证
• 2.3 技术路线
• 2.3.1 Bt 总DNA 的提取
• 2.3.2 sigE 和sigK 基因的克隆及测序
• 2.3.3 sigE 和sigK 基因敲除载体的构建
• 2.3.4 敲除载体与Bt 基因组间的同源重组
• 2.3.5 突变株的鉴定
• 2.3.6 突变株的形态观察
• 2.3.7 突变株的生长情况分析
• 2.3.8 突变株产生杀虫蛋白晶体能力分析
• 2.3.9 以lacZ 为报告基因的基因转录分析
• 2.3.10 突变株中外源cry1Ac 基因的表达情况分析
• 2.3.11 恢复株的构建
• 2.3.12 Bt G03 spoⅢAE 基因突变株中sigE 基因转录分析
• 2.3.13 Bs 168 spoⅢAE 基因突变株的基因转录分析
• 3 结果与分析
• 3.1 SIGE 和SIGK 基因的克隆与序列分析
• 3.1.1 sigE 基因的克隆与序列分析
• 3.1.2 sigK 基因的克隆与序列分析
• 3.2 敲除载体的构建与鉴定
• 3.2.1 敲除载体pMADE 的构建与鉴定
• 3.2.2 敲除载体pRNK 的构建与鉴定
• 3.3 缺失突变株的获得
• 3.3.1 突变株的PCR 鉴定
• 3.3.2 突变株的southern blotting 验证
• 3.4 突变株的生长特性
• 3.5 突变株的形态观察
• 3.6 突变株产杀虫蛋白能力的分析
• 3.7 以LACZ 为报告基因的转录分析
• 3.7.1 突变株中cry1Aa 启动子指导的β-半乳糖苷酶的活性分析
• 3.7.2 突变株中spoⅡD 启动子指导的β-半乳糖苷酶的活性分析
• 3.7.3 突变株中sigE 启动子指导的β-半乳糖苷酶活性分析
• 3.8 突变株中外源CRY1AC 基因的表达分析
• 3.8.1 突变株中外源cry1Ac 基因的表达分析
• 3.8.2 突变株中Cry1Ac-GFP 融合蛋白的表达分析
• 3.9 SIGE 和SIGK 恢复株的构建
• 3.9.1 sigE 恢复株的构建
• 3.9.2 sigK 恢复株的构建
• 3.10 BT G03 SPOⅢAE 基因突变株中SIGE 基因转录分析
• 3.11 BS 168 SPOⅢAE 基因突变株的基因转录分析
• 3.11.1 Bs 168 spoⅢAE 基因敲除载体pMAD3AE 的构建
• 3.11.2 Bs 168 spoⅢAE 突变株的获得
• 3.11.3 Bs 168 spoⅢAE 基因缺失突变株中spoⅡD 和sigE 的转录分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文