利用基因突变技术进行安普霉素单组分产生菌的选育

论文摘要

黑暗链霉菌H6（Streptomyces tenebrarius H6）产生三种抗生素：安普霉素、氨甲酰妥布霉素和少量氨甲酰卡那霉素B。多年来科研人员对黑暗链霉菌的研究主要集中于常规诱变育种和优化生产工艺等方面，虽然取得一些好的进展，但对其抗生素合成的途径了解较少。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程研究，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素产生等方面取得长足的进步。为获得黑暗链霉菌H6安普霉素单组分产生菌，对黑暗链霉菌H6染色体上的tacA基因进行基因进行阻断实验，利用基因突变技术来选育安普霉素单组分产生菌。利用PCR分别获得tacA基因内部523bp片段和1063bp片段，将两片段重新连接到pIJ2925内。在构建好的质粒中加入xylE报告基因和ermE基因做为筛选标记，构建基因阻断穿梭载体。转化到大肠杆菌DH-5α。经接合转移导入黑暗链霉菌H6，筛选双交换阻断变株。经发酵产物分析，阻断变株不再合成氨甲酰妥布霉素，只合成安普霉素。从而获得安普霉素单组分产生菌。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 1.安普霉素概述
• 2.链霉菌抗生素生物单组分的获得
• 3.结合转移
• 4.黑暗链霉菌中抗生素生物合成的研究进展
• 5.研究黑暗链霉菌H6中抗生素生物合成基因的立题方向
• 实验材料
• 1.菌种
• 2.质粒
• 3.试剂
• 4.缓冲液
• 5.培养基
• 6.仪器
• 实验方法
• 1.大肠杆菌质粒DNA小量提取
• 2.大肠杆菌质粒DNA大量提取
• 3.链霉菌质粒DNA的提取
• 4.链霉菌总DNA的提取
• 5.大肠杆菌DH-5α感受态细胞的制备
• 6.质粒DNA转化大肠杆菌
• 7.DNA酶切和连接
• 8.DNA电泳和片段回收
• 4DNA聚合酶补平试验'>9.T₄DNA聚合酶补平试验
• 10.PCR实验
• 11.接合转移实验
• 12.黑暗链霉菌发酵及检测操作的实验方法
• 12.1 发酵流程
• 12.2 抗生素组分检测
• 结果与讨论
• 第一部分 黑暗链霉菌妥布霉素生物合成基因tbmA的功能研究
• 1.tacA基因的功能研究
• 1.1 阻断载体的构建
• 1.2 接合转移实验
• 1.3 单交换基因阻断菌株的获得
• 1.4 基因阻断菌株体内游离质粒的考察
• 1.5 基因整合分析
• 1.6 阻断变株的发酵组分分析
• 2.讨论
• 参考文献
• 致谢