冻鲜马鹿茸蛋白成分的分离与活性初探

论文摘要

鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科动物梅花鹿（Cervus nippon Temminck）或马鹿（Cervus elaphus Linnaeus）的雄鹿未骨化而带茸毛的幼角加工而成的。古代医学认为,鹿之精气全在于角,而茸为角之嫩芽,气体全而未发泄,故补阳益血之力最盛。是峻补元阳、益寿延年的滋补药。现代研究表明,鹿茸具有多方面的药理活性。我国的霍玉书教授在1997年首次研究开发了鹿茸冻干粉,使对鹿茸的研究从常规化学成分转向生物大分子。国内外已经有许多专家学者对冷冻鲜茸的成分进行了研究分析及活性的检测。冻鲜茸优点是未经高温加工,保持鹿茸有效活性成分。本文以冻鲜塔里木马鹿茸为原料,运用Q-Sepharose和SP-Sepharose离子交换色谱,对鹿茸水溶性蛋白进行了初步分离,C,8高效液相色谱进行细分离,确定了最佳的高效液相分离条件。还对各离子交换色谱部位及凝胶色谱部位进行了细胞活性因子的活性筛选,具体内容包括：第一章采用单因素考察法,分别考察了不同匀浆方法,不同条件下的超高压提取法,不同pH值和不同盐离子强度对鹿茸水溶性总蛋白回收率的影响,确定了最佳提取条件。利用SDS-PAGE电泳法对冻鲜鹿茸粗提液,鹿茸冻干粉,鹿茸饮片蛋白质分子量范围作了考察,证明冻鲜方法相比于传统的热炸法,对鹿茸中水溶性蛋白,尤其是小分子蛋白起到很好的保留作用。第二章首先考察了以分子筛原理为基础,对鹿茸水溶性蛋白粗分离的不同方法,分别考察了卷式膜超滤法、超滤管离心法、醇沉法、G-50凝胶和Superdex 75凝胶对鹿茸水溶性蛋白中分子量小于20kDa蛋白的提取率,发现这些方法对鹿茸小分子蛋白回收率均不高,损失较大；于是转变思路,考察了以电荷原理为基础的离子交换色谱对鹿茸蛋白的粗分离,实验选用了强阴离子交换树脂Q-sepharose F. F.,对鹿茸酸性蛋白和碱性蛋白进行了粗分离,蛋白回收率和电泳结果表明,该法对鹿茸蛋白能进行很好的粗分离,并且回收率较高,于是确定了离子交换色谱法作为鹿茸蛋白粗分离的方法。第三章是本论文的重点部分,分别使用了强阴离子交换色谱Q-Sepharos F. F.和强阳离子交换色谱SP-Sepharose F. F.对鹿茸总蛋白进行了系统分离,分别考察了不同pH和不同离子强度I的起始缓冲液对鹿茸蛋白的回收率的影响,确定了最佳的起始缓冲液条件和洗脱条件,得到鹿茸酸性蛋白Q1-Q6,碱性蛋白SP1-SP5共11个部位,分别对这11个部位进行C1。高效液相色谱分离,摸索得到了最佳的液相分离条件,得到数个在反相柱上呈现单峰的物质及一个纯蛋白物质.第四章对鹿茸酸性蛋白Q1-Q6部位和Superdex75凝胶流分S1-S6部位进行了表皮生长因子（EGF）的ELISA试剂盒筛选,对SP1-SP5和Superdex75凝胶流分S1-S6部位进行了神经生长因子（β-NGF）和胰岛素生长因子（IGF-1）的ELISA试剂盒筛选,结果在流分S3-S5段中发现了IGF-1活性.本论文的特色主要有以下几个方面：1.保持鹿茸在冻鲜的状态下对其进行系统分离。2.初次利用离子交换的方法系统分离鹿茸水溶性蛋白,考察了最佳分离条件。3.对各离子交换段进行C18高效液相色谱分离,摸索得到了最佳的液相分离条件,得到数个在反相柱上呈现单峰的物质及一个纯蛋白物质。4.对鹿茸各部位进行活性筛选,在Superdex 75凝胶色谱流分S3-S5段发现IGF-1活性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 一 鹿茸活性成分研究进展
• 1.1 鹿茸简介
• 1.2 鹿茸的研究概况
• 1.3
• 1.3.1 鹿茸研究新思路:细胞生长因子库
• 1.3.2 鹿茸生长因子研究概况
• 二 蛋白质成分分离研究方法综述
• 2.1 蛋白质分离的准备
• 2.2 蛋白质的提取和溶解
• 2.3 蛋白质溶液的浓缩
• 2.4 蛋白质的分离和纯化手段
• 2.5 蛋白质的分析和检测手段
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 实验流程图
• 第一章 鹿茸中水溶性总蛋白提取工艺的研究
• 1 仪器与材料
• 1.1 仪器
• 1.2 试剂
• 1.3 对照品与药材
• 2 方法与结果
• 2.1 蛋白质含量测定方法学的建立
• 2.2 不同匀浆方法对鹿茸水溶性蛋白回收率的考查
• 2.3 不同条件下的超高压提取法对鹿茸水溶性蛋白回收率的考察
• 2.4 不同pH的提取溶剂对蛋白回收率影响的考察
• 2.5 不同盐离子强度的缓冲液对鹿茸总蛋白回收率的考察
• 2.6 SDS-PAGE电泳对不同加工工艺鹿茸蛋白分子量范围的检测
• 3 小结与讨论
• 讨论
• 第二章 鹿茸水溶性蛋白粗分方法探索
• 一 利用蛋白质分子量大小对鹿茸水溶性蛋白粗分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 二 离子交换法鹿茸水溶性总蛋白的粗分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 第三章 鹿茸水溶性蛋白的系统分离
• 一 强阴离子交换树脂对鹿茸酸性蛋白的系统分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 二 RP-HPLC对鹿茸酸性蛋白成分的分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 三 强阳离子交换树脂对鹿茸碱性蛋白的系统分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 四 RP-HPLC对鹿茸碱性蛋白成分的分离
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 3 小结与讨论
• 第四章 鹿茸水溶性蛋白的细胞因子活性检测初探
• 一 ELISA法测定鹿茸各蛋白部位的EGF活性
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 二 ELISA法测定鹿茸各蛋白部位的NGF活性
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 三 ELISA法测定鹿茸各蛋白部位的IGF-1活性
• 1 仪器与材料
• 2 方法与结果
• 本章小结与讨论
• 参考文献
• 第五章 总结
• 致谢
• 个人简历