利用转基因策略创造高淀粉、高直链淀粉玉米新种质

论文摘要

玉米是最重要的粮食和饲料作物之一,也是食品和化工的重要原料,在人类生活中起着举足重轻的作用。全世界淀粉年产量为3600万吨,其中80%以上是玉米淀粉,加强高淀粉玉米育种具有重要的社会效益和经济效益。直链淀粉是重要的工业原料,用途广泛,涉及到各个领域,如食品、塑料、医疗等行业。但是普通玉米的直链淀粉含量约22%-28%,从普通玉米提取直链淀粉成本很高。目前,我国所需的直链淀粉主要依赖进口,价格昂贵。采用常规育种技术选育高直链淀粉玉米遇到的主要问题是玉米淀粉总含量减少,籽粒含水分量增高,利用基因工程技术进行高直链淀粉玉米品种培育是一种值得探索的途径。过表达AGPase提高玉米淀粉含量和籽粒产量淀粉合成的主要场所是淀粉体和叶绿体,整个过程受到一系列酶活性的调控。ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是淀粉合成途径的限速酶,主要功能是把1-磷酸葡萄糖转化为合成淀粉的底物ADPG。过表达AGPase基因有可能提高AGPase的活性,促进淀粉合成。玉米AGPase是由两个大亚基和两个小亚基组成的异四聚体,大、小亚基分别由Sh2和Bt基因编码。该酶在玉米籽粒发育和淀粉合成中发挥着至关重要的作用。本工作通过RT-PCR的方法从玉米胚乳cDNA中克隆出玉米AGPase的大、小亚基基因Sh2和Bt2,选用玉米胚乳特异性启动子启动Sh2和Bt2基因表达,以除草剂抗性基因为选择标记,构建出Sh2、Bt2单基因过表达植物载体和二者串联的过表达植物载体。采用农杆菌介导的玉米芽尖遗传转化方法,将三种载体上目标基因分别转入玉米骨干自交系昌7-2和掖478。PCR和Southern检测证明,外源基因整合到转基因玉米植株的基因组内,并在后代中稳定表达,选择来源于不同独立转化体的且外源基因单拷贝插入的株系进行转基因表达、淀粉合成、籽粒产量及其它农艺性状的研究。对不同灌浆期（10DAP,15DAP,20DAP,30DAP）的转基因纯合植株及其野生型对照的籽粒进行基因表达分析和酶活性测定,对成熟后的种子进行淀粉含量分析和百粒重测定,发现AGPase基因的表达和酶活性在籽粒发育前期都随着发育进程而增加,在20DAP时达到高峰,随后缓慢下降。在检查的转基因植株中AGPase基因的表达强度显著高于非转基因植株的,酶活性也发生相应的变化,转Sh2或Bt2基因的植株变化幅度小于转Sh2和Bt2双基因的植株的,转Sh2基因和Bt2基因的植株之间的差异不明显。成熟种子的淀粉含量分析表明,淀粉含量的变化与基因表达和酶活性变化呈现一致的趋势。在转Sh2或Bt2基因的株系中,淀粉含量分别由野生型的66%（昌7-2）或65%（掖478）升高到71-74%不等；而转Sh2和Bt2双基因的株系中,淀粉含量增加到76-78%,较野生型对照提高约16.7%。转基因植株的百粒重也有明显提高,与对照昌7-2相比,转基因株系的百粒重分别提高20%（Bt2）、18%（Sh2）和30%（Bt2Sh2）；与对照掖478相比,转基因株系的百粒重分别提高22%（Bt2）、20%（Sh2）和33%（Bt2Sh2）。通过不同株系植株的盆栽和大田比较试验得出,转基因植株生长正常,果穗长、穗行数、籽粒数等与对照植株的差异不显著,而穗重、百粒重、淀粉含量则变化显著,较非转基因植株有明显提高。果实籽粒大小也有明显变化,转Sh2和Bt2双基因的植株增加最显著。在本工作采用来自玉米醇溶蛋白基因的胚乳特异型启动子,大大增强了AGPase基因在玉米胚乳中的表达。过表达Bt2基因或Sh2基因都能提高AGPase活性,而Bt2和Sh2基因的共同过表达将AGPase活性提高到一个显著水平。这意味着玉米胚乳AGPase活性的增强可能是通过增强四聚体数量及其稳定性来实现,胚乳Sh2或Bt2蛋白的大量增多使AGPas四聚体更趋于稳定或有更多的四聚体形成。灌浆期胚乳AGPase活性的增加,不仅可加速碳水化合物的转化和转运,促进胚乳淀粉合成,提高种子的增重速率,间接促进光合作用,最终提高玉米产量。因此,可通过提高玉米胚乳内AGPase活性培育出光合效率高、籽粒产量高和淀粉含量高的玉米新品种。本工作是一个成功的实例,为培育玉米优良自交系提供一个切实可行的途径。利用RNAi机制创制高直链淀粉玉米新材料直链淀粉的合成受多基因控制,复杂的基因环境互作也参与影响胚乳直链淀粉的含量。增加胚乳直链淀粉的含量往往伴随着产量和其它农艺性状的降低。淀粉分支酶是淀粉生物合成过程中一个起重要调节作用的酶,它能切开葡萄糖间的α（1,4）糖苷键,并把切下的短链通过α（1,6）糖苷键连接于受体链上,形成分枝结构,抑制淀粉分支酶基因的表达可降低酶活性,从而减少支链淀粉合成,提高直链淀粉的含量。玉米淀粉分支酶SBE可分为三种同工酶SBEI、SBEIIa和SBEIIb,其中SBEIIb对胚乳直链淀粉含量的作用最大。本论文通过RT-PCR的方法从玉米胚乳cDNA中克隆出玉米淀粉分支酶基因SB Ella、IIb的特异区和保守区片段,分别构建出SBE的RNAi结构,后者由胚乳特异的启动子P27Kd或组成性启动子35S驱动。为了获得最优的干扰效果,使直链淀粉大幅度的提高以满足塑料工业的需要,分别以SBEIIa和SBEIIb保守序列为基础,构建出hpRNA臂长分别为893bp和467bp的RNAi结构；以SBEIIa中长度为417bp和154bp的特异序列分别与SBEIIb的一段295bp的特异序列相连接,构建不同的hpRNA结构；选用不同RNAi结构内含子和不同的启动子,构建具有特定的RNAi结构。通过常规的分子生物学技术,将这些RNAi结构重组到植物表达载体中,获得了10个具有不同特点的植物表达载体。通过农杆菌介导法将不同RNAi结构导入玉米骨干自交系昌7-2,从转化植株后代中筛选出7个转化结构生产的稳定转基因株系。除草剂抗性筛选、PCR检测和Southern blotting验证及转基因表达强度分析肯定我们获得了转基因纯合株系,RNAi结构稳定插入到玉米基因组中。选择来源于不同独立转化体且外源基因单拷贝插入的转RNAi结构的株系进行农艺性状观察和基因表达强度、SBE酶活性、籽粒淀粉含量、直链淀粉含量测定,得出转入的RNAi结构有效抑制了SBEⅡ基因的表达,大幅度降低了胚乳SBE的酶活性,与野生型对照相比显著提高了直链淀粉含量,植株形态特征和生长发育无明显变化,但总淀粉含量及籽粒产量有一定降低。在灌浆期20DAP时测定SBEⅡ的基因表达强度和SBE酶活性,得出转RNAi结构的植株SBEⅡ的基因表达强度和SBE酶活性都有不同程度的降低,转35S启动RNAi结构的株系抑制效率低于27Kd启动的；用SBEIIb不同长度的保守序列构建的RNAi结构,干扰效果差别不大；由SBEIIa和SBEIIb特异区构建的RNAi结构抑制效果最好。含较短内含子的RNAi结构抑制效率相对较高。测定转RNAi结构植株和对照植株的成熟种子的胚乳直链淀粉和总淀粉含量,对带有不同RNAi结构的株系进行比较,得出以SBEIIb保守区为基础构建的不同臂长的RNAi结构对直链淀粉含量的影响彼此无明显差异,而以SBEIIa特异序列和SBEIIb特异序列相连构成的RNAi结构似乎臂长712bp的优于349bp的；由SBEIIa特异序列和SBEIIb特异序列相连构成的RNAi结构提高直链淀粉的幅度大于仅由SBEIIb保守序列组成的；P27Kd启动子驱动的RNAi结构对直链淀粉提高的程度高于35S启动子驱动的,并且转基因植株形态和生长发育更类似于野生型对照的；用catalase intron替换pFGC5941载体中的内含子可使合成更多的直链淀粉。伴随着胚乳直链淀粉含量的增加,籽粒淀粉总含量和百粒重降低。同时干扰SBEIIa和SBEIIb的株系直链淀粉含量达到55%（盆栽）或54%（大田）,总淀粉含量不到60%,总淀粉含量较非转基因对照65%降低了10%,而百粒重只有17g,约为非转基因对照的（20.2g/100粒）84%。抑制SBE的活性,对淀粉合成可能有限制作用,从而导致淀粉含量减少、百粒重的降低。在田间比较试验中,通过对转基因植株的株高、穗位高、果穗长、穗重等多个性状的分析,得出转基因植株性状与非转基因植株相比较变化不明显,只是在转35S启动子驱动的RNAi结构植株中株高和叶片面积低于野生型的。本工作获得了玉米高直链淀粉新种质,并为玉米RNAi结构的设计和采用转基因技术获得高直链淀粉玉米的工作积累了重要资料。通过转基因植株的杂交培育高淀粉高直链淀粉玉米材料采用RNAi的方法,我们得到了直链淀粉高达55%的玉米株系,而总淀粉含量却低于野生型对照的,为了解决总淀粉含量降低,产量下降的问题,有必要将能够提高淀粉合成限速步骤的过表达载体引入高直链淀粉玉米体中,使其胚乳内AGPase的活性能够得到提高,从而推动有更多的碳水化合物用于胚乳淀粉合成,增加淀粉含量和玉米产量。本工作中,用于杂交的亲本材料选取淀粉含量最高的转AGPase大小亚基基因的转基因植株和RNAi效果较好高直链淀粉植株,转基因材料的受体基因型均为昌7-2。以3个转过表达基因的植株为父本,以3个转RNAi结构的植株为母本,这些植株分别来自不同的转基因纯合株系,进行成对杂交,产生转基因聚合的F1代。Southern杂交结果显示,过表达AGPase基因结构和RNAi结构均存在于转基因聚合植株的基因组中。将带有过表达AGP酶基因和RNAi结构的转基因聚合植株F1代、未转基因对照的姊妹交种子、高淀粉玉米姊妹交种子和高直链淀粉姊妹交种子播种于相同的花盆中,在适应条件下生长,套袋自交,测定籽粒20DAP时的目标基因表达水平和酶活性,籽粒成熟干燥后成对胚乳淀粉含量和直链淀粉含量,同时观察记载植株形态特征和株高、百粒重等农艺性状的变化。在转基因聚合株系胚乳中,Bt2、Sh2的表达丰度较父本玉米植株的稍低,仍显著高于未转基因对照的,AGPase活性表现出相同的变化趋势；而SBEⅡ的表达水平较母本略有升高,但达不到差异显著水平,仍大幅度低于未转基因对照的,SBE活性变化表现出同样趋势。即在转基因聚合株系中,过表达AGPase和抑制SBE都得到实现。测定胚乳淀粉含量和直链淀粉含量,得出转基因聚合植株的直链淀粉含量虽较母本有所下降,但依然高于50%,远大于未转基因对照的28%。转基因聚合植株的淀粉含量约71%,比非转基因对照（66%）提高了6%,但与高淀粉父本植株（78%）相比仍有较大差距。转基因聚合植株生长发育生长,株高、穗位高、穗长和籽粒表型较非转基因植株变化不显著,但转基因聚合植株的百粒重比转RNAi结构的高直链淀粉植株提高了18%以上,比未转基因对照昌7-2相近或略高。即转基因聚合植株中既拥有较高的直链淀粉含量、又有提高了淀粉含量,为获得高淀粉高直链淀粉含量的玉米提高了成功的实例。综上所述,本论文工作首次获得了利用过表达AGPase大小亚基双基因的方法使玉米淀粉含量和籽粒体积显著提高的高淀粉玉米新种质；以RNAi技术获得了淀粉含量达55%的高直链淀粉玉米,并比较了不同RNAi结构对靶基因表达的抑制效果；通过不同转基因植株杂交的方式实现过表达AGPase基因和抑制SBEⅡ基因表达在玉米胚乳中同时实现,获得了高淀粉高直链淀粉玉米新材料。这些工作为培育具有巨大经济价值的高淀粉玉米、高直链淀粉玉米和高淀粉高直链淀粉玉米进行了有益尝试,为培育高淀粉、高淀粉高直链淀粉玉米提供有效方法和途径。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 前言
• 1.1 淀粉的基本特性和用途
• 1.2 淀粉合成机制
• 1.2.1 淀粉合成相关酶类
• 1.2.2 腺苷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）
• 1.2.2.1 AGPase的定位及特点
• 1.2.2.2 AGPase的大小亚基的功能与特点
• 1.2.2.3 AGPase酶活性的改变及对作物淀粉含量的影响
• 1.2.3 淀粉合成酶（SS）
• 1.2.4 淀粉分支酶（SBE）
• 1.2.4.1 SBE的分类及特点
• 1.2.4.2 SBE编码基因的表达及特点
• 1.2.4.3 SBE基因的功能研究
• 1.2.5 淀粉去分支酶（SDBE）
• 1.3. 改良玉米淀粉含量和性质的可行途径
• 1.3.1 利用突变基因改变淀粉含量及理化性质
• 1.3.2 RNAi技术在淀粉改良中的应用
• 1.3.2.1 RNAi机制的原理
• 1.3.2.2 RNAi在植物改良中的应用
• 1.3.2.3 双链RNA结构的合成和RNAi载体的设计原则
• 1.3.2.4 RNAi表达结构的构建
• 1.3.2.5 通过抑制SBE活性提高直链淀粉的研究
• 1.4 玉米基因工程改良研究的现状
• 1.5 本研究的目的与意义
• 第二章 过表达AGPASE提高玉米淀粉含量和籽粒产量
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料和菌种及质粒载体
• 2.1.2 基因克隆和植物表达载体的构建
• 2.1.2.1 玉米cNDA的合成
• 2.1.2.2 AGPase大、小亚基基因的克隆
• 2.1.2.3 植物表达载体的构建
• 2.1.3 转基因玉米的产生
• 2.1.3.1 转化受体的获得
• 2.1.3.2 农杆菌培养
• 2.1.3.3 农杆菌介导的玉米芽尖转化
• 2.1.3.4 转基因株系的产生
• 2.1.4 转基因玉米的分子检测
• 2.1.4.1 PCR检测
• 2.1.4.2 转基因玉米的Southern杂交检测
• 2.1.4.3 定量RT-PCR检测
• 2.1.5 转基因玉米的性状分析
• 2.1.5.1 酶活性检测
• 2.1.5.2 淀粉含量检测
• 2.1.5.3 植株产量的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 目的基因的克隆
• 2.2.1.1 mRNA的分离和cDNA的合成
• 2.2.1.2 玉米AGPase小亚基基因Bt2的克隆及鉴定
• 2.2.1.3 玉米AGPase大亚基基因Sh2的克隆及鉴定
• 2.2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.3 转基因植株的获得
• 2.2.4 转基因玉米的分子检测
• 2.2.5 转基因植株的AGPase活性测定
• 2.2.6 籽粒淀粉含量分析
• 2.2.7 转基因玉米籽粒性状的分析
• 2.2.7.1 百粒重分析
• 2.2.7.2 不同转基因株系的籽粒表型的差异
• 2.2.7.6 田间测产结果
• 2.3 讨论
• 第三章 利用RNAI机制创制高直链淀粉玉米新材料
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料和菌种及质粒载体
• 3.1.2 目的基因的获得
• 3.1.2.1 玉米cDNA的合成
• 3.1.2.2 靶基因片段的克隆
• 3.1.2.3 PCR产物的回收、克隆及测序
• 3.1.3 干扰载体的构建
• 3.1.4 转基因玉米的产生
• 3.1.5 转基因玉米的分子检测
• 3.1.6 转基因植物的生理学测定和性状分析
• 3.1.6.1 酶活性检测
• 3.1.6.2 淀粉含量检测
• 3.1.6.3 株系选择和产量测定
• 3.1.6.4 转基因植株农艺性状的大田观察
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 玉米淀粉分支酶基因SBEⅡa、SBEⅡb干扰片段的克隆和序列分析
• 3.2.2 RNAi表达载体的构建和鉴定
• 3.2.3 转基因玉米的分子检测
• 3.2.3.1 PCR检测
• 3.2.3.2 Southern检测
• 3.2.3.3 靶基因表达强度的分析
• 3.2.4 SBE酶活性检测
• 3.2.5 转基因植株籽粒淀粉含量和直链淀粉含量的影响
• 3.2.6 转SBEⅡ RNAi结构对玉米百粒重及产量的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 通过转基因植株的杂交培育高淀粉高直链淀粉玉米材料
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 材料的准备
• 4.1.2.2 检测方法
• 4.1.2.3 果穗性状和产量测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 转基因植株的分子生物学鉴定
• 4.2.2 转基因表达分析
• 4.2.3 AGPase和SBE的酶活性检测
• 4.2.4 转基因聚合植株籽粒淀粉和直链淀粉含量的变化
• 4.2.5 植株性状分析
• 4.3 讨论
• 第五章 总结与展望
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文及专利
• 学位论文评阅及答辩情况表