论文摘要
光是视觉系统进化和发育的动力,视网膜是感受外界光线形成视觉的重要组织结构,外界光线只有到达功能正常的视网膜才能形成视觉图像。但是,当光线的光强度、光照时间等超过了视网膜的承受力,将会造成视网膜的光损伤。视网膜是视觉器官中重要组织结构,很容易受到光的损伤。由于眼的屈光介质有很强的聚焦作用,可将入射光束会聚成很小的光斑,从而使视网膜单位面积上接受的光能比入射到角膜的光强约105倍。早在17世纪瑞士医生Bonetus就描述了日光引起的视力损害。1966年Noell等报道,一定量的光,即使低于热损伤的阈值,也可引起受试小鼠的视网膜损伤。烈日下太阳光照度可高达130000lux以上,尤其是在高山、沙漠、海岛及舰船甲板等环境中会增强光的辐射作用,强光下无特殊防护很容易发生视网膜光损伤。以往实验通常采用日光灯、手术显微镜等较低照度的可见光,较长时间照射造成光损伤。本实验采用光谱最接近太阳光的氙灯作为致伤光源,30000lux模拟晴天少云时的太阳光,滤光片滤掉红外光线,不会引起明显的温度升高,减少实验动物的热损伤,实验条件接近太阳光对视网膜的损伤。以往对视网膜光损伤病理学改变的研究多集中在损伤后的早期,本实验对光损伤后视网膜的病理学改变进行了较长时间的动态观察。目的:本课题从组织形态等方面研究视网膜光损伤后感光细胞的改变特征及其发生机制。通过30000lux光照射兔眼,采用光镜、透射电镜与末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（in situterminaldeoxynucleotibyl transferase mediated dUTP-digoxigenin（biotin） nick end-labeling,TUNEL）技术对光损伤后视网膜感光细胞的病理学改变进行动态观察,探讨强日光照射对视网膜组织结构的影响及光损伤的致伤机理。方法:一、实验动物选取月龄相当、健康成年新西兰白兔25只,雌雄不限,体重2～2.5kg。随机将动物分为3组。正常对照组5只兔,15min光照组5只兔和30min光照组15只兔（分别在光照后2d、7d和14d各取5只兔进行观察）。动物室内相对湿度40%～60% ,室内温度21～24℃。所有实验用家兔均在自然明及暗各12 h的自然循环光环境下适应7 d,强光照前暗适应24 h。二、光损伤模型的建立将实验兔双眼分别用复方托品酰胺散大瞳孔至8mm,将光照组兔固定（只有头部外露）,放置开睑器使兔眼暴露在氙灯光照下,滤光片滤掉红外光线,光源照度为30000lux。根据分组照射时间分别控制在15min和30min,暗适应30min后送回动物室正常条件下饲养,15min光照组在光照后2d取材进行观察,30min光照组在光照后2d、7d和14d不同时间分别取材进行观察。正常饲养组散瞳后不予光照,饲养2d后取材观察。三、光学显微镜观察全麻下摘取实验动物眼球,去除眼前节,放入10%福尔马林溶液中固定48小时。自视神经根颞侧lPD处作矢状切面取材,石蜡包埋,5μm连续切片,常规HE染色与TUNEL标记染色,光学显微镜下观察。四、透射电镜观察全麻下摘取实验动物眼球,去除眼前节,2.5%戊二醛固定2小时（4℃）;取视神经根颞侧lPD处的视网膜,切成1mm×0.5mm矩形组织块;磷酸缓冲液冲洗三次;1%锇酸固定2小时;双蒸水冲洗三次;梯度酒精脱水;置换2次;纯树脂包埋;修块,半薄切片,天青-美兰染色,光镜下定位观察;超薄切片,醋酸双氧铀,枸橼酸铅染色;Philips EM208s电镜观察五、视网膜细胞凋亡检测切片常规脱蜡水化;将一烧杯盛200ml的0.01 M、pH6.0的柠檬酸缓冲液,加热至90～95℃,迅速放入切片,加入双蒸水（20～25℃）80ml作迅速冷却,将玻片移至PBS（20～25℃）洗3次;加20%正常牛血清室温30 min;将TUNEL反应混合液加在切片上,37℃温育90min（阴性对照片、TUNEL混合液中不加TDT）;PBS洗3次;3%H2O2甲醇液室温阻断10min;37℃温育90min;加POD转化剂,37℃温育30min;PBS洗5min×3次;DAB/H2O2显色;苏木素淡染,常规脱水,透明,中性树胶封固。在TUNEL标记切片的视网膜后极部随机选取5个视野,分别计数感光细胞总数及呈阳性着色的凋亡感光细胞数,取其平均值并计算感光细胞凋亡率。六、统计学分析:所有实验数据采用Excel记录,利用SPSS 13.0 for Windows统计学软件对两组均数间比较行t检验,以x±s表示,以P < 0.05为差异有统计学意义的判定标准。结果:一、光学显微镜观察正常组视网膜组织未见明显病理改变,结构清晰完整。15min光照组2d时观察,杆体锥体层结构紊乱,界线不清;外颗粒层细胞核排列疏松紊乱,可见细胞间水肿;内颗粒层细胞核排列疏松紊乱;神经节细胞层偶见细胞核消失,胞浆呈空泡状。30min光照组2d时观察,杆体锥体层结构明显紊乱,界线不清,可见组织断裂;外颗粒层细胞核排列疏松紊乱,细胞间水肿明显增多;内颗粒层细胞核排列疏松紊乱,细胞核消失,胞浆呈空泡状;神经节细胞层多数细胞核消失,胞浆呈空泡状。30min光照组7d时观察,杆体锥体层可见大部分组织断裂崩解;外颗粒层细胞核排列疏松紊乱,部分细胞核消失,胞浆呈空泡状;内颗粒层细胞核排列紊乱,细胞核数量明显减少,胞浆呈空泡状;神经节细胞层绝大部分细胞核消失,胞浆呈空泡状。30min光照组14d时观察,杆体锥体层结构比较整齐,断裂崩解组织明显修复;外颗粒层细胞核排列比较整齐,偶见细胞胞浆呈空泡状;内颗粒层细胞核排列比较整齐;神经节细胞层可见部分细胞核消失,胞浆呈空泡状。二、透射电镜观察正常组视网膜结构基本正常。15min光照组2d时观察,杆体锥体层外节膜盘结构紊乱,板层结构离散,内节线粒体肿胀,个别嵴断裂;外颗粒层细胞胞浆有空泡样改变;内颗粒层胞浆轻度肿胀;神经节细胞层细胞形态基本正常。30min光照组2d时观察,杆体锥体层外节膜盘结构紊乱,板层结构重度离散,内节线粒体肿胀,嵴断裂;外颗粒层细胞胞浆有空泡样改变;内颗粒层胞浆轻度肿胀;神经节细胞胞浆轻度肿胀。30min光照组7d时观察,杆体锥体层外节膜盘组织结构紊乱,板层结构消失,空泡化,内节线粒体肿胀,嵴断裂;外颗粒层细胞胞质肿胀,大量空泡样改变,排列紊乱,部分胞膜破坏;内颗粒层胞浆高度肿胀,呈空泡样改变,可见部分胞膜破坏;神经节细胞可见胞浆肿胀,胞膜破坏。30min光照组14d时观察,杆体锥体层外节膜盘组织结构较规则,板层结构比较致密,内节线粒体肿胀,嵴断裂;外颗粒层细胞胞浆肿胀减轻,排列较整齐;内颗粒层胞浆肿胀减轻,排列较整齐;神经节细胞胞浆肿胀减轻。三、视网膜细胞凋亡检测正常组视网膜TUNEL染色均为阴性。光照后各组外颗粒层出现散在分布的阳性表达细胞,表现为颗粒状黄色或棕黄色着色,定位于细胞核,部分胞核边缘着色深,中央着色浅,呈指环状外观。15min光照组2d时感光细胞凋亡率为13.23%±0.86%,30min光照组2d时感光细胞凋亡率为13.26%±1.54%, 30min光照组7d时感光细胞凋亡率为29.54%±1.44 %, 30min光照组14d时感光细胞凋亡率为29.21 %±0.99%。15min光照组2d时感光细胞凋亡率与30min光照组2d时感光细胞凋亡率两者无显著性差异（P>0.05）;30min光照组2d时感光细胞凋亡率与30min光照组7d时以及30min光照组14d时比较均具有显著性差异（P<0.05）;30min光照组7d时感光细胞凋亡率与30min光照组14d时感光细胞凋亡率两者无显著性差异（P>0.05）。结论:一、本实验采用光谱最接近太阳光的氙灯作为致伤光源,30000lux模拟晴天少云时的太阳光,滤光片滤掉红外光线,不会引起明显的温度升高,减少实验动物的热损伤,实验条件接近太阳光对视网膜的损伤,成功构建太阳光视网膜损伤模型。二、本实验发现30000lux模拟日光照射白兔眼15min光照组2d时就发现对视网膜造成光损伤。本实验发现30000lux模拟日光照射白兔眼15min,2d后可观察到视网膜的光损伤病理改变。证实短时间强光照射就可导致视网膜的光损伤。三、以往对视网膜光损伤病理学改变的研究多集中在损伤后的早期。本实验对光损伤后视网膜的病理学改变进行了较长时间的动态观察,结果发现视网膜结构的损伤是从一个非急性的持续加重到逐渐修复的过程。