栉江珧微卫星标记的筛选及其遗传多样性的研究

论文摘要

由于微卫星DNA标记具有多态性高、信息含量大、共显性和保守性等特点,目前,微卫星DNA标记已被广泛应用于动物遗传育种研究中,可有效地进行群体遗传多样性分析,为动物品种的保护和利用提供理论依据。目前,利用微卫星标记对水产动物的遗传育种学研究已不少见,但对栉江珧群体的研究尚未见到报道。本文采用磁珠富集法筛选栉江珧（Atrina pectinata）的微卫星分子标记。用限制性内切酶MseI对基因组DNA酶切,然后用T4连接酶连接MseI接头和酶切产物,再用生物素标记的（GT）13寡核苷酸探针与连接过的片段杂交,再通过磁珠富集将杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上,然后将这些片段洗脱、PCR扩增、连接入pMD18-T载体、转入用CaCl2制备的感受态大肠杆菌中。总计获得了71个阳性克隆,含有101个微卫星序列,其中完美型67个,占77.0%,不完美型25个,占28.7%,混合型9个,占10.3%。除探针使用的AG重复序列外,还观察到CT、GA、ATG的重复序列。微卫星的重复次数主要集中于5-30次之间,占82.4%,最高重复次数为84次。在分析侧翼序列的基础上,设计了38对微卫星引物,经PCR筛选,有24对能扩增出目的片断,其中15对在群体中具有多态性。结果显示,磁珠富集法是获得微卫星分子标记的一种有效方法,可以预见,磁珠富集法制备微卫星技术将广泛地运用到水产动物的遗传育种学研究中去,从而加速水产动物遗传育种研究进程。根据磁珠富集法筛选的微卫星序列,设计并筛选了15对多态性较强的引物,以32个三亚海区栉江珧样本为研究对象,对其进行了遗传分析。15个微卫星标记位点在群体中共检测到54个等位基因,观测等位基因数在2-5个,平均有效等位基因数为3.9个,群体内固定系数为-0.0607,群体观测杂合度为0.3625,期望杂合度为0.6052,平均多态信息含量（PIC）为0.5387,达到高度多态（PIC＞0.5）。结果表明,我国三亚海区的栉江珧目前仍具有较高的遗传多样性,遗传信息丰富,遗传变异大,可以作为良好的育种材料。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 遗传标记
• 1.1 形态学标记
• 1.2 细胞遗传学标记
• 1.3 生物化学遗传标记
• 1.4 分子遗传学标记
• 2 分子遗传学标记
• 2.1 RFLP技术
• 2.2 RAPD技术
• 2.3 AFLP技术
• 2.4 SNP技术
• 2.5 微卫星（SSR）技术
• 2.5.1 微卫星的结构及功能
• 2.5.2 微卫星形成机理
• 2.5.3 微卫星位点分析方法
• 2.5.4 微卫星DNA标记的特点
• 3 微卫星标记在水产动物遗传育种学研究中的运用
• 3.1 种群的遗传多样性分析
• 3.2 群体遗传结构分析
• 3.3 遗传连锁图谱的构建
• 3.4 种质资源的评价与保护
• 3.5 亲缘关系鉴定及杂种优势分析
• 3.6 QTL定位
• 4 栉江珧基础生物学研究现状
• 4.1 地理分布调查
• 4.2 生态习性调查
• 4.3 繁殖习性研究
• 4.4 生化及分子生物学方面的研究
• 5 结语
• 第二章 磁珠富集法筛选栉江珧微卫星标记
• 1 前言
• 2 实验的材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器设备
• 2.3 主要试剂、药品
• 2.4 试验方法
• 2.4.1 基因组DNA的提取与检测
• 2.4.1.1 基因组DNA的提取
• 2.4.1.2 基因组DNA的检测
• 2.4.2 酶切与连接
• 2.4.2.1 酶切
• 2.4.2.2 连接
• 2.4.3 连接产物扩增
• 2.4.4 杂交与富集
• 2.4.4.1 杂交
• 2.4.4.2 磁珠预处理
• 2.4.4.3 富集
• 2.4.5 扩增含有微卫星序列的DNA片段
• 2.4.6 回收纯化
• 2.4.7 目的DNA片段的体外连接
• 2.4.8 连接产物的转化
• 2.4.8.1 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞
• 2.4.8.2 转化
• 2.4.9 做菌液PCR
• 2.4.10 序列测定
• 2.4.11 微卫星引物设计
• 3 结果
• 3.1 基因组DNA提取
• 3.2 基因组DNA酶切
• 3.3 扩增结果
• 3.4 富集结果
• 3.5 菌液PCR
• 3.6 阳性克隆测序结果
• 4 讨论
• 第三章 栉江珧遗传多样性分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 基因组提取
• 2.2.2 引物的筛选及合成
• 2.2.3 PCR反应程序及体系
• 2.2.3.1 反应体系
• 2.2.3.2 反应程序
• 2.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.4.1 胶的制备
• 2.2.4.2 银染
• 2.2.5 统计分析
• 2.2.5.1 微卫星基因型的判断
• 2.2.5.2 等位基因数
• 2.2.5.3 有效等位基因数
• 2.2.5.4 观测杂合度
• 2.2.5.5 期望杂合度
• 2.2.5.6 平均杂合度
• 2.2.5.7 多态信息含量
• 2.2.5.8 群体内固定系数
• 3 结果
• 3.1 PCR扩增结果
• 3.2 等位基因频率
• 3.3 微卫星多态性分析
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录1 实验试剂及配制
• 附录2 已发表或己接收的论文
• 致谢