猪繁殖与呼吸综合征抗体免疫胶体金快速诊断试纸的研制

论文摘要

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种繁殖障碍与呼吸系统传染病。猪是此病的唯一天然宿主。该病以接触性、高度传染性、高发病率,慢性和高死亡率为特征。病猪生长十分缓慢,甚至停滞生长,严重影响养猪业的经济效益,因此对该病及时作出诊断有利于降低经济损失。本研究针对目前PRRS诊断耗时长的问题,运用胶体金免疫层析技术建立PRRS抗体快速诊断方法。本研究以PRRSV POP3毒株为试验材料,结合使用中性盐沉淀法和凝胶层析法获得其结构蛋白,经SDS-PAGE电泳检测显示含六条蛋白条带,分子量分别为：68.1KD、55.2KD、38.9KD、37.6KD、35.1KD、33.9KD,其中55.2KD.38.9KD.37.6KD、35.1KD、33.9KD为PRRSV蛋白。用纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白制备铝胶疫苗免疫2kg左右成年健康家兔,获得的兔抗PRRSV高免血清与纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白经双向琼扩试验,检测到抗血清效价为1：16。采用辛酸-硫酸铵盐析分离纯化血清IgG,经SDS-PAGE检测显示分子量为56.5KD和26.6KD的蛋白条带。以柠檬酸三钠为还原剂制备胶体金,用紫外分光光度计（400nm-700nm）扫描分析显示,制备的胶体金颗粒大小均一,约为19.76nm,适合免疫标记。以制备好的胶体金标记纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白,获得稳定的免疫胶体金。确定最佳标记条件为：pH=7.8,病毒蛋白的标记结合量为4.8μg/ml。用标记好的免疫胶体金浸泡聚酯纤维素膜,干燥后制得金标垫。同时将纯化的PRRSV POP3株病毒蛋白和兔抗PRRSV IgG分别作为诊断试纸的检测线（T线）和控制线（C线）包被于硝酸纤维素膜（NC膜）上,组装成试纸条。确定了免疫胶体金的稀释度为1：1,T线包被浓度为1 mg/ml,C线包被浓度为2mg/ml。用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测。结果显示ELISA法检测阳性率为75%,PRRS抗体诊断试纸检测阳性率为61.1%。用PRRS抗体试纸条检测与ELISA检测方法进行比较,结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%,重复性良好。试验证明PRRS抗体试纸条具有高效、价廉、敏感性高、特异性强、操作简便便于基层推广的实际运用价值。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.前言
• 1.1 PRRSV的理化性质
• 1.2 PRRSV的生物学特性
• 1.2.1 抗体依赖性增强作用
• 1.2.2 毒株变异和毒力差异
• 1.3 PRRSV的流行病学和危害性
• 1.4 PRRS的诊断方法概述
• 1.4.1 临床及病原学诊断
• 1.4.2 血清学诊断
• 1.4.3 分子生物学诊断
• 1.5 胶体金技术的研究进展
• 1.5.1 胶体金技术的原理
• 1.5.2 胶体金的制备
• 1.5.3 免疫胶体金的标记
• 1.5.4 免疫胶体金技术在诊断中的应用
• 1.6 目的与意义
• 2.试验材料
• 2.1 试验毒株及培养材料
• 2.2 实验动物
• 2.3 主要仪器设备及器材
• 2.4 SDS-PAGE相关溶液
• 3.试验方法
• 3.1 病毒培养及病毒蛋白纯化
• 3.1.1 病毒的复苏及培养
• 3.1.2 PRRSV毒力试验（96孔盘法）
• 3.1.3 PRRS病毒蛋白纯化
• 3.2 PRRSV高免血清的制备
• 3.3 辛酸-硫酸铵盐析分离免疫血清IgG
• 3.4 胶体金制备及质量评价
• 3.4.1 还原法制备胶体金
• 3.4.2 胶体金的质量评价
• 3.5 免疫胶体金的制备
• 3.5.1 免疫胶体金标记最适pH值的测定
• 3.5.2 免疫胶体金标记最佳蛋白浓度的确定
• 3.5.3 免疫胶体金标记
• 3.6 试纸条的研制
• 3.6.1 免疫胶体金稀释度和抗原抗体包被浓度的确定
• 3.6.2 免疫诊断试纸的组装
• 3.6.3 PRRS抗体免疫胶体金快速诊断试纸检测结果判读
• 3.6.4 重复性试验
• 3.6.5 稳定性试验
• 3.6.6 特异性试验
• 3.6.7 符合性试验
• 4 试验结果
• 4.1 病毒培养
• 4.2 PRRSV毒力试验
• 4.3 PRRS病毒蛋白纯化
• 4.4 免疫血清IgG的分离
• 4.5 胶体金的制备及质量评价
• 4.6 免疫胶体金的制备
• 4.6.1 免疫胶体金标记最适pH值的测定
• 4.6.2 胶体金标记最佳病毒蛋白浓度的确定
• 4.7 试纸条的研制
• 4.7.1 免疫胶体金稀释度及抗原抗体包被浓度的确定
• 4.7.2 试纸条初试
• 4.7.3 重复性试验
• 4.7.4 稳定性试验
• 4.7.5 特异性试验
• 4.7.6 符合性试验
• 5. 讨论
• 5.1 PRRSV毒力试验及病毒蛋白纯化
• 5.2 免疫血清制备和IgG的分离
• 5.3 胶体金的制备
• 5.4 免疫胶体金的制备
• 5.5 试纸条的制作和初步应用
• 6. 结论
• 参考文献
• 致谢