柑橘原生质体融合及体细胞杂种核质遗传研究

论文摘要

原生质体融合技术能有效克服柑橘有性杂交不亲和、雌和／或雄性败育以及珠心胚干扰等问题，实现核DNA和胞质DNA重组，为柑橘遗传改良提供了一条新的途径。本研究旨在针对我国一些优良柑橘品种种子多的问题，拟采用“胞质体-原生质体”融合和非对称融合，将温州蜜柑控制雄性不育的胞质因子转入有籽品种中，以获得新的柑橘无核种质。此外，本研究对本实验室以前通过原生质体融合获得的4个组合的体细胞杂种植株进行了核质遗传分析。主要研究结果如下： 1．开展了柑橘胞质体分离的研究，建立了高效的柑橘胞质体分离体系。首先以柑橘胞质雄性不育材料-温州蜜柑国庆1号（Citrus unshiu）的胚性悬浮系为试材分离原生质体，再通过不连续的甘露醇-蔗糖梯度和超速离心方法分离胞质体；比较了不同的离心速度、离心时间、离心温度、梯度组分的体积和浓度对胞质体分离的影响，结果表明，转速为38000r／min，温度为25℃，离心20min，15％蔗糖浓度（悬浮原生质体的下层溶液）是分离胞质体最适宜的条件，可获得纯度为90％的胞质体；胞质体的平均直径为23.2μm；使用FDA染色，发现胞质体的活力在75-85％之间；采用低熔点琼脂糖包埋培养，48h后胞质体破裂死亡。 2．开展了柑橘“胞质体-原生质体”融合，获得了国庆1号（C. unshiu，cv. GuoqingNo. 1）+诺瓦橘柚（C. reticulata×C. paradisi）、国庆1号（C. unshiu，cv. Guoqing No. 1）+默科特橘橙（C. reticulata×C. sinensis）2个组合的再生愈伤组织和胚状体。前一组合得到的愈伤组织在诱导胚状体的2％甘油培养基上未见进一步生长和分化；从后一组合，挑出的44个单个小愈伤培养在2％甘油培养基上，有3个分化出胚状体。对后一组合再生的三个细胞系进行倍性和核质基因组分析，结果表明，再生的细胞系均为二倍体，核DNA来自默科特橘橙，而线粒体DNA来源于国庆1号。 3．研究了紫外线（UV）照射柑橘原生质体作为喂养层培养目标原生质体的效果，发现UV照射的原生质体作饲养层具有促进愈伤原生质体生长的作用，而对叶肉原生质体的生长无促进作用；研究了UV对柑橘原生质体DNA片段化的影响。结果表明，UV处理后的原生质体比未处理的原生质体发生较高的DNA片段化。 4．开展了UV处理供体的非对称融合研究，获得了国庆5号（C. unshiu，cv. Guoqing No. 5）+默科特橘橙（C. reticulata×C. sinensis）、国庆1号（C. unshiu，cv. Guoqing No. 1）+诺瓦橘柚（C. reticulata×C. paradise）、国庆1号（C. unshiu，cv. Guoqing No. 1）+锦橙（C. sinensis）共3个组合的再生愈伤组织和芽。其中前2个组合获得了愈伤组织，后一个组合再生了芽，采用FCM、RAPD、AFLP和CAPS对再生的四个芽系进行鉴定，结果表明，再生的芽系为二倍体、三倍体或四倍体的体

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 问题的提出
• 2 前人研究进展
• 2.1 柑橘原生质体融合研究进展
• 2.1.1 柑橘原生质体融合方法
• 2.1.2 柑橘原生质体融合方式
• 2.1.2.1 柑橘对称融合研究
• 2.1.2.2 柑橘非对称融合研究
• 2.1.2.3 柑橘亚原生质体融合研究
• 2.1.3 柑橘体细胞杂种在育种上的应用
• 2.2 柑橘体细胞杂种核质遗传研究进展
• 2.2.1 柑橘体细胞杂种核遗传
• 2.2.2 柑橘体细胞杂种胞质遗传
• 2.2.2.1 柑橘体细胞杂种线粒体遗传
• 2.2.2.2 柑橘体细胞杂种叶绿体遗传
• 2.3 植物亚原生质体分离及融合研究进展
• 2.3.1 植物胞质体分离及融合
• 2.3.1.1 植物胞质体分离
• 2.3.1.2 “胞质体-原生质体”融合
• 2.3.2 植物微原生质体分离及融合
• 2.3.2.1 植物微原生质体分离
• 2.3.2.2 微原生质体融合
• 3 本研究的目的和内容
• 第二章 柑橘胞质体分离与融合研究
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 原生质体分离与纯化
• 2.2.2 胞质体分离
• 2.2.3 胞质体鉴定
• 2.2.4 “胞质体-原生质体”融合,培养及再生
• 2.2.5 再生产物鉴定
• 2.2.5.1 再生材料的FCM分析
• 2.2.5.2 细胞学检查
• 2.2.5.3 总DNA的提取
• 2.2.5.5 RAPD分析
• 2.2.5.4 SSR分析
• 2.2.5.6 AFLP分析
• 2.2.5.7 CAPS分析
• 3 结果与分析
• 3.1 温州蜜柑胞质体分离体系的建立
• 3.1.1 离心后胞质体分离层的形成
• 3.1.2 分离参数的优化
• 3.1.2.1 离心转速
• 3.1.2.2 离心时间
• 3.1.2.3 离心温度
• 3.1.2.4 梯度组成及体积
• 3.1.3 胞质体的鉴定与培养
• 3.2 “胞质体-原生质体”融合和再生体系建立
• 3.2.1 电融合参数的优化
• 3.2.2 融合再生情况
• 3.3 “国庆1号+默科特橘橙”再生物的杂种鉴定
• 3.3.1 倍性分析
• 3.3.2 核来源
• 3.3.3 再生胚状体的胞质来源
• 4 讨论
• 4.1 甘露醇-蔗糖梯度超速离心方法用于分离胞质体的可行性
• 4.2 分离大量高纯度的植物胞质体可采用的模式程序
• 4.3 本研究中未能得到再生植株的可能原因
• 4.4 “胞质体-原生质体”融合体系应用于胞质基因转移的前景
• 第三章 柑橘转移CMS性状的非对称融合
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 原生质体分离与纯化
• 2.2.2 原生质体预处理
• 2.2.2.1 紫外线（UV）辐射
• 2.2.2.2 碘乙酸（IA）处理
• 2.2.3 原生质体活力测定和核形态观察
• 2.2.4 紫外线照射原生质体的DNA片段化检测
• 2.2.5 紫外线处理原生质体做饲养层培养原生质体
• 2.2.6 原生质体融合、培养及再生
• 2.2.7 再生产物鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 紫外线（UV）对原生质体的影响
• 3.1.1 紫外线对原生质体活力和再生的影响
• 3.1.2 紫外线照射原生质体引起的DNA片断化
• 3.2 紫外线处理的原生质体做饲养层培养目标原生质体的效果
• 3.3 FDA和H33258双染色统计原生质体活力
• 3.4 非对称融合再生与鉴定
• 3.4.1 非对称融合再生情况
• 3.4.2 “国庆1号+锦橙”再生物的杂种鉴定
• 3.4.2.1 倍性分析
• 3.4.2.2 核组成分析
• 3.4.2.3 胞质DNA分析
• 4 讨论
• 4.1 紫外线用于植物非对称体细胞杂交的前景
• 4.2 植物体细胞杂种的再生优势现象
• 第四章 柑橘体细胞杂种核质遗传分析
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 倍性分析
• 2.2.2 总DNA的提取、SSR分析、CAPS分析
• 2.2.3 SRAP分析
• 3 结果与分析
• 3.1 属间体细胞杂种组合核质分析
• 3.1.1 澳洲指橘+酸橙
• 3.1.1.1 倍性分析
• 3.1.1.2 核DNA来源
• 3.1.1.3 胞质DNA来源
• 3.1.2 丹西红橘+长寿金柑
• 3.1.2.1 倍性分析
• 3.1.2.2 核DNA来源
• 3.1.2.3 胞质DNA来源
• 3.2 种间体细胞杂种组合核质分析
• 3.2.1 沙漠蒂甜橙+酸橙
• 3.2.1.1 倍性分析
• 3.2.1.2 核DNA来源
• 3.2.1.3 胞质DNA来源
• 3.2.2 丹西红橘+红江橙
• 3.2.2.1 倍性分析
• 3.2.2.2 核DNA来源
• 3.2.2.3 胞质DNA来源
• 4 讨论
• 4.1 对称融合产生二倍体叶肉亲本型胞质杂种的原因
• 4.2 柑橘对称融合方式产生非对称体细胞杂种的现象
• 4.3 体细胞杂种的SRAP标记鉴定
• 参考文献
• 致谢
• 附录 攻读博士学位期间发表论文