论文摘要
细菌内毒素（endotoxin）或称脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,是所有革兰阴性细菌（G-）细胞壁外膜上的主要结构成分,是G-细菌主要的致病因子。临床上严重烧伤、创伤患者往往面临感染的威胁,甚至发展成为脓毒症或多器官功能衰竭。目前尚无有效拮抗LPS的药物应用于临床。已发现存在于生物体内的一些中和LPS活性成分具有潜在的药用开发价值,如鲎抗内毒素因子（limulus antilipopolysaccharide factor, LALF）,LALF是从鲎蓝色血液中分离鉴定的一种具有抗菌及中和LPS作用的蛋白,我们在前期工作中以LALF为模板通过计算机模拟设计,应用固相化学合成得到了多条模拟肽,并进行了活性初筛,本研究将继续对其中3条环化肽XS10/REMP1/REMP2进行抗LPS及抗菌活性实验检测。第一部分、XS10/REMP1/REMP2体外中和内毒素及抗菌活性研究。方法:1. XS10 /REMP1 /REMP2直接中和LPS实验:以多黏菌素B（PMB）为对照,不同浓度模拟肽溶液分别与LPS工作标准品溶液直接混合反应,应用EDS-99细菌LPS测定系统,测定反应后溶液中LPS含量,计算中和率。2. XS10 /REMP1 /REMP2对LPS介导的小鼠RAW264.7细胞产生TNF-α的抑制作用:以PMB为对照,将PMB及各模拟肽梯度浓度溶液和LPS溶液同时加入细胞培养液中,孵育一定时间后用ELISA试剂盒检测细胞上清液内的TNF-α含量。3. XS10 /REMP1 /REMP2最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）测定:采用琼脂稀释法,对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等标准菌株及临床分离菌株进行MIC测定。4. REMP1 /REMP2对E.coli ATCC 25922形态的影响:分别将一定浓度的REMP1和REMP2加入大肠杆菌标准菌株E.coli ATCC 25922培养液中,作用一定时间后,透射电镜下观察E.coli ATCC 25922的形态学变化。5. XS10 /REMP1 /REMP2细胞毒性实验:采用MTT实验测定。结果:1. XS10 /REMP1 /REMP2均有不同程度的直接中和LPS的作用.并且随浓度升高而增强,中和能力从强到弱依次为REMP2 >REMP1> XS10,以REMP2最强,在0.01～100μM浓度下对1.0EU/ml的LPS中和率分别为:（5.66±2.08）%～（88.66±5.03）%,接近PMB中和能力。2. XS10 /REMP1 /REMP2在10μM、20μM、40μM、80μM浓度下,均能不同程度抑制LPS介导的TNF-α产生,与阳性对照组比较P<0.05,且随着浓度增高,TNF-α的分泌量逐渐减少。呈现出显著的浓度梯度效应。3.三种模拟肽均表现出一定的抗菌活性,对各种细菌的MIC为16～256μg/ml,抑菌活性从强到弱分别为REMP1 > REMP2 > XS10, REMP1和REMP2还对属于革兰阳性细菌的金黄色葡萄球菌表现出一定的抑菌活性。4.电镜下REMP1或REMP2作用后大肠杆菌内外膜变模糊、毛糙,菌体肿胀,胞质空泡变性,有的菌体裂解破碎。5. XS10 /REMP1 /REMP2三种模拟肽对RAW264.7细胞无毒性作用。第二部分XS10 / REMP1 / REMP2体内抗内毒素活性研究方法:1. D-氨基半乳糖（D-Gal）致敏昆明小鼠LPS休克模型的建立:不同剂量的D-Gal和LPS先后1h腹腔注射于昆明小鼠,找出LD100的最佳剂量组合。2. XS10 /REMP1 /REMP2对LPS休克小鼠保护的剂量效应:复制昆明小鼠LPS休克模型,观察三种模拟肽在0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg剂量下与LPS同时注射时对小鼠的保护率。3.不同时间注射REMP2对LPS休克小鼠的保护效应:观察LPS攻击前1h和LPS攻击后1h注射REMP2（2.0mg/kg）对LPS休克小鼠的保护率。4. XS10 / REMP1 / REMP2对LPS休克小鼠血清TNF-α的影响:用ELISA法检测模拟肽作用后LPS休克小鼠血清TNF-α的变化。5. REMP1、REMP2对LPS休克小鼠重要脏器的病理学影响:REMP1、REMP2与LPS同时注射于D-Gal致敏小鼠后5h,取小鼠心脏、肺脏、肝脏、小肠、肾脏常规病理学检查。结果:1.预先注射D-Gal可使昆明小鼠对LPS敏感性极大增强,D-Gal 500mg/kg + LPS 250μg /kg组及D-Gal 600mg/kg + LPS 50μg/kg组小鼠72h内死亡率达100%。模型复制采用D-Gal 600mg/kg + LPS 50μg/kg剂量组合。2. 0.5、1.0、2.0mg/kg三种剂量下,XS10、REMP1、REMP2对LPS休克小鼠均有一定保护作用,REMP2保护作用最强,保护率依次为30%、60%和90%,与PMB比较P>0.05。3. LPS攻击前1h和攻击后1h注射REMP2对LPS休克小鼠的保护率分别为30%和50%,保护效果均低于同时注射组。4. LPS攻击后75分钟TNF-α升高至6365±2087 pg/ml,PMB及模拟肽作用组TNF-α水平降低,REMP1和REMP2组分别为3811±1236 pg/ml和905±264 pg/ml,与LPS组比较P<0.05,REMP2组与PMB组比较P>0.05。5. D-Gal组除肝脏有轻微病理改变外,其余脏器无病理改变,LPS组小鼠各脏器均出现炎症性病理改变,尤以肺脏和肝脏明显,REMP1和REMP2组各脏器病变程度减轻。结论1.环状鲎抗内毒素因子模拟肽XS10、REMP1、REMP2在溶液内可以直接中和LPS,使溶液内所能检测到的LPS减少。2.XS10、REMP1、REMP2对LPS刺激下小鼠RAW264.7细胞所产生的炎症介质TNF-α有抑制作用。3.XS10、REMP1、REMP2对临床常见的革兰阴性杆菌具有一定杀菌作用,而且还对金黄色葡萄球菌（革兰阳性菌）有一定抑制作用。4.MTT实验表明XS10、REMP1、REMP2没有细胞毒性。5.XS10、REMP1、REMP2可以降低LPS休克小鼠的死亡率。6.XS10、REMP1、REMP2能够降低LPS休克小鼠血清TNF-α水平。7.REMP1、REMP2可以减轻LPS休克小鼠心脏、肺脏、肝脏、肾脏、小肠的炎性病理变化。8.三种模拟肽各自在体外和体内的抗LPS及抗菌活性表现一致,抗LPS活性从强到弱依次为REMP2 >REMP1 > XS10,抗菌活性从强到弱依次为REMP1 > REMP2 > XS10。9.模拟肽REMP2体内外的抗LPS活性与PMB相当,并且无细胞毒性,具有潜在的药用开发价值。
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- [1].基于半体内法研究利胆排毒方抗内毒素活性部位[J]. 中国药师 2017(03)
- [2].抗内毒素蛋白的研究进展[J]. 上海畜牧兽医通讯 2009(02)
- [3].板蓝根中4(3H)-喹唑酮的抗内毒素作用[J]. 华西药学杂志 2008(01)
- [4].丹皮的抗内毒素和解热作用研究[J]. 中药药理与临床 2012(03)
- [5].十五味赛尔斗丸抗内毒素作用实验研究[J]. 中药药理与临床 2012(05)
- [6].水翁花的镇痛和抗内毒素研究[J]. 中华中医药学刊 2011(07)
- [7].斑马鱼内毒素炎症模型建立及中药抗内毒素炎症研究[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2019(09)
- [8].布渣叶抗内毒素和急性毒性实验研究[J]. 中国药房 2011(23)
- [9].板蓝根中3-(2'-羧基苯基)-1(3H)-喹唑酮的抗内毒素作用研究[J]. 时珍国医国药 2008(02)
- [10].三黄方抗内毒素活性的谱效相关性研究[J]. 时珍国医国药 2011(03)
- [11].板蓝根三氯甲烷提取部位抗内毒素作用的“谱效”关系研究[J]. 中国药学杂志 2011(10)
- [12].血浆高密度脂蛋白抗内毒素损伤的研究[J]. 实用全科医学 2008(06)
- [13].谈姜黄素抗内毒素肝损伤的中医理论思考[J]. 中国医药导报 2008(24)
- [14].海桐种子醇提物中挥发性成分的GC-MS分析及抗内毒素活性测定[J]. 中国现代应用药学 2018(02)
- [15].斑马鱼内毒素炎症模型构建及及中药抗内毒素炎症活性筛选[J]. 中国药理学与毒理学杂志 2019(09)
- [16].锦花清热胶囊抗内毒素作用实验研究[J]. 浙江大学学报(医学版) 2017(01)
- [17].板蓝根与抗内毒素药效作用及化学基础研究[J]. 吉林医学 2013(27)
- [18].4种注射液抗内毒素作用的研究[J]. 中药材 2015(06)
- [19].健脾活血方抗内毒素诱发大鼠急性肝损伤的主效应中药筛选验证及药理作用环节点分析[J]. 中华中医药杂志 2012(04)
- [20].β-环糊精选择性提取虎杖化学成分及体外抗内毒素活性研究[J]. 上海中医药杂志 2008(08)
- [21].牡丹皮抗内毒素活性研究[J]. 第三军医大学学报 2012(14)
- [22].抗内毒素Fab’体外对LPS的拮抗作用[J]. 免疫学杂志 2009(03)
- [23].12种广东地产清热解毒药的抗内毒素作用研究[J]. 今日药学 2013(05)
- [24].HDL能抵抗内毒素引起得小鼠损伤[J]. 现代生物医学进展 2009(04)
- [25].大黄抗内毒素有效组分血清药物化学研究[J]. 中药药理与临床 2008(02)
- [26].白蔹生品与炮制品体外抗内毒素作用的比较研究[J]. 药学实践杂志 2019(03)
- [27].白鲜皮生物碱抗内毒素活性的研究[J]. 第三军医大学学报 2012(20)
- [28].头孢他啶诱导内毒素释放及清开灵注射液抗内毒素作用的体外试验研究[J]. 中国药房 2008(31)
- [29].我国科学家发现抗生素替代品——新型抗菌抗内毒素双效肽[J]. 中国乳业 2017(05)
- [30].四季青水煎液体外抗内毒素、抗菌和体内抗炎作用[J]. 中国抗生素杂志 2018(06)