论文摘要
[目的]在大鼠创伤性深静脉血栓动物模型基础上,针对深静脉血栓形成前、形成高峰期两个关键时相点,对实验大鼠股静脉基因芯片检测结果应用多种信息学方法进行分析,重点关注炎症相关基因的变化,确定出与血栓形成密切相关的炎症基因,进行同源性对比,在血管组织层面和血液层面进行RT-PCR检测验证,探讨IL-1β、IL-6作为预测诊断大鼠创伤性深静脉血栓新分子标记物的可行性和可靠性,为研发可用于临床基因芯片预测诊断试剂盒奠定基础。[材料和方法]第一部分大鼠TDVT形成前期、高峰期血栓形成组、不形成组血管组织炎症差异表达基因分析及其与人基因同源性对比1、本次试验分两次进行,第一次实验150只SD大鼠,第二次试验250只SD大鼠;根据造模后观察时相点和/或血栓存在状态进行分组。两次实验均分为4组,分别是正常对照组（A组）,血栓形成前（C组）、高峰期血栓形成组（D组）和高峰期血栓不形成组（G组）;2、两次实验均采用本课题组自创的双侧大腿定量打击+石膏外固定法进行造模。实验大鼠不麻醉,采用创伤定量打击装置,瞬间打击能量为5焦耳,分别击打大鼠双侧大腿近端外侧各1次,髋人字石膏固定,观察大鼠双足颜色和肿胀情况;3、取材:在相应的时相点,先通过肉眼观察初步确定血栓的状态,每组纳入10只大鼠,分别切取双侧长约4-5cm的股静脉,每条股静脉再切取长约0.5cm的组织以进行HE染色、光镜观察确定血栓形成的状态;4、选择符合分组条件的各组股静脉血管同组混合,采用Trizol一步法提取总RNA,用2%琼脂糖凝胶电泳检测其质量;5、质检合格的各组RNA样品进行生物素标记,采用Genechip Rat Genome 230 2.0芯片进行杂交、扫描和芯片数据处理;6、采用倍数变化分析筛选出各时相点与A组比较的差异表达基因（上调基因:Log2Ratio≥1,且Change标注为Ⅰ;下调基因:Log2Ratio≤—1,且Change标注为D）,并进行GO分类;7、将C组、D组、G组与炎症相关的差异表达基因数据以probeset ID为统一标准进行排序、合并;8、采用Cluster聚类分析方法分析炎症相关的差异表达基因,较直观显示C组、D组及G组之间差异表达基因群的变化;9、采用FC方法进一步分析,通过调节相关参数,确定显著差异表达基因,参数设定为Single Log2Ratio≥2.3或Single Log2 Ratio≤-2.3,D组与G组基因表达量≥100;10、BLAST同源性比对:将FC分析方法筛选出的显著差异表达基因在NCBI网站中的GENE中查询其在人类和大鼠中的基因序列,将两者的基因序列代入BLAST中进行比对,明确与人类基因的同源性。第二部分RT-PCR检测大鼠血液、组织中IL-1β、IL-6预测诊断大鼠创伤性深静脉血栓相关性研究1、在大鼠血液中以RT-PCR检测A、C、D、G组IL-1β和IL-6 mRNA的表达;2、在大鼠血管组织中以RT-PCR检测A、C、D、G组IL-1β和IL-6 mRNA的表达;3、分别比较血液细胞RT-PCR检测、血管组织RT-PCR检测、血管组织基因芯片检测IL-1β和IL-6 mRNA的表达量的不同变化。[结果]第一部分大鼠TDVT形成前期、高峰期血栓形成组、不形成组血管组织炎症差异表达基因分析及其与人基因同源性对比1、在该模型中,股静脉血栓发生于造模后72h,第一次实验D组50.0%股静脉内有血栓形成,第二次试验D组48.2%股静脉内有血栓形成。2、纳入相应分组的各组血管组织肉眼和光镜的观察结果在血栓形成方面基本一致。3、各组取材和总RNA基因芯片检测顺利完成,质量监测评估2批检测均为合格。4、在该病理过程中共有2458个基因呈现差异性表达,其中上调基因1146个（Log2Ratio≥1,且Change标注为Ⅰ）,下调基因1312个（Log2Ratio≤-1,且Change标注为D）。大部分差异表达的基因功能目前尚不清楚,已知功能基因主要为参与凝血-抗凝血、纤溶-抗纤溶、炎症、免疫的基因。5、在基因芯片中共确定出55个炎症相关基因,其中19个炎症相关基因在此过程中呈现差异性表达。6、Cluster聚类分析结果显示55个炎症相关基因中,IL-1、IL-6和Cinc2等表现为一簇,该簇基因表达水平与血栓形成和演化呈同向变化。7、FC方法分析,确定出炎症相关的显著差异表达基因共4个为:IL-1β、IL-6、CXCL2和CCL3。8、D组、G组炎症显著差异表达基因与人类基因的BLAST同源性比对:IL-6为87.7%;IL-1β为86.7%;CCL3为78.5%;CXCL2为58.6%。第二部分RT-PCR检测大鼠血液、组织中IL-1β、IL-6预测诊断大鼠创伤性深静脉血栓相关性研究1、经RT-PCR扩增曲线验证,IL-1β、IL-6的RT-PCR检测结果扩增效率高;2、经RT-PCR溶解曲线验证,IL-1β、IL-6的RT-PCR检测结果有效、灵敏度高;3、IL-1β、IL-6的血液细胞RT-PCR检测结果与血管组织RT-PCR检测结果一致,灵敏度介于血管组织RT-PCR检测及血管组织基因芯片检测之间。【结论】1、应用基因芯片技术检测大鼠创伤性深静脉血栓模型血管组织,锁定了可以在组织层面预测诊断大鼠TDVT的分子标志物IL6及IL1β:2、应用Blast对比证实了IL6及IL1β在人类与大鼠间的高度同源性,推测其可以作为人深静脉血栓的预测指标。3、IL6、IL1β在血液中的变化趋势与在血管组织中一致,可以通过在血液中进行检测来预测诊断大鼠深静脉血栓。
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