论文摘要
目的:缺血-再灌注损伤是临床常见的一种病理生理现象,涉及许多疾病的发生机制并影响其预后。现已证实,在心、脑、肾、肝、肺、肢体及皮肤等多种组织器官都存在缺血-再灌注损伤的现象。近年来,随着人民生活水平的不断提高,医疗技术的不断进步,缺血性疾病成为临床常见病、高发病。心肌梗塞、休克、心肺复苏等均可引起全身组织器官的缺血-再灌注损伤,如何降低缺血-再灌注造成的机体损害,保护心、脑等重要脏器的功能,是目前医学研究的热点问题。良好的血液循环是组织细胞获得充足的氧和营养物质供应并排出代谢产物的基本保证,各种原因造成的组织血流量减少均可使细胞发生缺血性损伤,尽早恢复组织的血流灌注是减轻缺血性损伤的根本措施。但是,在动物实验和临床观察中发现,恢复血液再灌注后,部分细胞功能代谢障碍及结构破坏反而加重,因而将这种血液再灌注后缺血性损伤进一步加重的现象称为缺血-再灌注损伤。缺血-再灌注损伤是在缺血性损伤的基础上发展而来的,再灌注可以使可逆性缺血损伤加重,亦可能促进可逆性缺血损伤转化为不可逆性损伤。但并不是所有缺血的组织器官都会发生缺血-再灌注损伤,缺血的时间长短、侧枝循环的建立、需氧程度以及再灌注的条件均可影响其发生及程度。大脑是人体最重要的生命器官,而且对氧的需求量很高,容易发生缺血-再灌注损伤。从1990年发现脑缺血可引起神经元凋亡后,许多学者致力于此方面的研究,近年来,脑短暂缺血后再灌注损伤所导致的迟发性神经元死亡（delayed neuronal death, DND）一直是研究脑缺血-再灌注损伤的热点。研究已证明脑缺血-再灌注损伤引起的DND就是细胞凋亡。细胞凋亡又称程序化死亡,是主动的、信号依赖的细胞自杀死亡。细胞凋亡区别于坏死,在其细胞内容物外溢之前即被吞噬细胞吞噬,故不引起炎症反应,是一种主动的、受细胞内某些死亡基因控制的过程。细胞凋亡广泛参与了很多疾病的病理过程,如肿瘤、先天性疾病、自身免疫性疾病、脏器移植时的免疫排斥反应、组织变性、伤口愈合等。近年来发现,缺血-再灌注损伤与细胞凋亡有密切联系。细胞凋亡是受基因编码调控的,脑缺血后,凋亡相关基因及其表达产物产生了变化,导致细胞凋亡的发生。探索细胞凋亡的相关基因,研究其调节凋亡的机制,通过抑制细胞凋亡从而减少或防止缺血-再灌注损伤,成为防治脑缺血性损伤的新思路。尼莫地平作为脑保护剂在急性缺血性脑血管疾病的治疗中具有重要作用,其作用机制尚不十分清楚。研究表明,在神经细胞凋亡中,钙信号异常是细胞变性、坏死的“最后通道”。尼莫地平系二氢吡啶类衍生物,属L-型Ca2+通道阻滞剂,它具有亲脂性,可通过血脑屏障进入中枢神经系统,高度特异性与二氢吡啶类受体结合,调节Ca2+的跨膜转运。它能特异性阻断电压依赖钙通道,减少Ca2+内流,防止细胞内的钙超载。本研究应用最新的流式细胞检测技术检测大鼠全脑缺血-再灌注后海马区细胞凋亡率及Bcl-2、Bax基因表达来观察尼莫地平对大鼠全脑缺血-再灌注后海马区细胞凋亡的影响,探讨尼莫地平可能存在的作用机制。方法:1动物与分组:选取健康成年雄性Wistar大鼠54只,体重在230～250克。随机分为三组:假手术组（A组,6只）、盐水对照组（B组,24只）、药物治疗组（C组,24只）。B、C组又根据干预起始时间点0h（再灌注即刻）、6h、12h、24h不同各自分为1、2、3、4四组。每组6只大鼠。2模型制备:采用四条血管阻断方法（Pulsinelli-4VO法）制备大鼠全脑缺血-再灌注模型。具体步骤为:将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉,背位固定后,于颈后1、2颈椎处切一切口,剥离颈部肌肉暴露第一颈椎双侧翼小孔,插入微型双极电凝镊,电凝椎动脉,使之永久闭塞,缝合伤口,置笼喂养。24小时后同法麻醉动物,腹位固定,颈前正中切口,分离双侧颈总动脉,用微动脉夹同时阻断双侧血流,检查远端血流情况以确保完全阻断血流,15分钟后,移去动脉夹,观察双侧颈总动脉血流恢复后,丝线缝合伤口。缺血过程中,检查双侧瞳孔,如瞳孔散大,说明产生全脑缺血;如瞳孔无变化,则认为未产生全脑缺血,应剔除。再灌注后,有瞳孔固定、癫痫、抽搐等并发症的均予放弃。低温对脑缺血损伤有保护作用,为避免温度对实验结果的影响,维持肛温在37±0.5℃。假手术组只进行手术操作,不阻断血管。盐水对照组分别于再灌注后0h、6h、12h、24h时间点开始及以后的各时间点累积腹腔注射生理盐水5ml/kg·次,药物治疗组分别于再灌注后0h、6h、12h、24h时间点开始及以后的各时间点累积腹腔注射尼莫地平注射液（山东新华制药股份有限公司规格:10mg/50ml）1mg/kg·次。各组于再灌注48h统一处死。3标本制作:于假手术及再灌注后48h麻醉动物（10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射）,迅速断头取脑,将大脑于矢状面切成两半,分离双侧海马组织,置于70%酒精中4℃保存待检。4流式细胞仪检测:采用美国Beckman Coulter公司生产的Epics-XLⅡ型流式细胞仪,将海马组织制备成单细胞悬液,300目铜网过滤除去细胞团块,离心2min（500～800r/min）。取1×105细胞（0.1ml）加入碘化丙啶1ml,在4℃避光下行DNA染色,加入鼠抗人单克隆抗体工作液、羊抗鼠FITC-LgG二抗工作液作免疫荧光标记,上机检测,检测前以鸡红细胞作为标准样品,调整仪器的变异系数（CV）在2%以内。激发光源为15mW氩离子激光器,激发波长为488nm,应用Expo32 ADC进行免疫荧光数据分析,用Muticycle AV分析软件对DNA细胞周期拟合分析。5统计学分析:数据均以均数±标准差（X±S）表示,采用SAS 6.12统计软件分析,组间比较利用方差分析,两两比较运用Dunnett-t检验,P<0.05为有统计学意义。结果:1凋亡百分率:A组细胞凋亡率为（2.16±0.14）;B1组细胞凋亡率为（13.45±2.38）,B2组细胞凋亡率为（15.07±0.56）,B3组细胞凋亡率为（13.99±1.73）,B4组细胞凋亡率为（13.61±1.52）;C1组细胞凋亡率为（3.02±0.26）,C2组细胞凋亡率为（4.37±0.55）,C3组细胞凋亡率为（5.31±0.37）,C4组细胞凋亡率为（8.06±0.74）。经方差分析检验,F值为120.18,P值小于0.01,表明各组之间差异显著。组间比较:A/B1、B1/C1、B2/C2、B3/C3之间有明显统计学差异,P<0.01;B4/C4之间有统计学差异,P<0.05;A/C1之间无统计学差异,P>0.05。对照组组内比较:B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之间均无统计学差异,P>0.05。治疗组组内比较:C1/C2、C2/C3之间无明显差异,P>0.05;C1/C3、C1/C4、C2/C4、C3/C4之间比较均有统计学差异,P<0.05。2 Bcl-2、Bax蛋白的表达（均道值）A组表达微弱,在此忽略。B组及C组荧光指数（FI）均大于1.0,为阳性表达。2.1 Bcl-2蛋白的表达（均道值）B1组Bcl-2蛋白表达的均道值为（196.03±103.18）,B2组为（271.07±90.62）,B3组为（260.77±90.16）,B4组为（260.30±95.85）;C1组Bcl-2蛋白表达的均道值为（680.25±57.47）,C2组为（630.36±59.02）,C3组为（513.64±34.98）,C4组为（446.44±34.56）。经方差分析检验,F值为13.80,P值远小于0.01,表明各组之间差异显著。组间比较结果如下:B1/C1之间有统计学差异,P<0.01;B2/C2、B3/C3、B4/C4之间有统计学差异,P<0.05。组内比较结果如下:B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之间均无统计学意义,P>0.05;C1/C2、C1/C3、C2/C3、C3/C4之间无明显差异,P>0.05,C1/C4、C2/C4之间有统计学意义,P<0.05。2.2 Bax蛋白的表达（均道值）B1组Bax蛋白表达的均道值为（765.49±90.59）,B2组为（753.56±61.41）,B3组为（752.62±39.37）,B4组为（742.70±89.53）;C1组Bax蛋白表达的均道值为（365.53±42.95）,C2组为（463.62±40.95）,C3组为（529.20±49.17）,C4组为（587.69±29.84）。经方差分析检验,F=41.12,P值远小于0.01,各组之间差异显著。组间比较结果如下:B1/C1之间有明显差异,P<0.01;B2/C2、B3/C3、B4/C4之间有统计学差异,P<0.05。组内比较结果如下:B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之间均无统计学意义,P>0.05;C2/C3、C3/C4之间无明显差异,P>0.05,C1/C2、C1/C3、C1/C4、C2/C4之间均有统计学差异, P<0.05。3 Bcl-2/Bax值B1组Bcl-2/Bax值为（0.26±0.14）,B2组为（0.36±0.13）,B3组为（0.35±0.13）,B4组为（0.36±0.16）;C1组Bcl-2/Bax值为（1.88±0.27）,C2组为（1.37±0.13）,C3组为（0.98±0.11）,C4组为（0.76±0.06）。经方差分析检验,F=89.94,P值远小于0.01,各组之间差异显著。组间比较结果如下:B1/C1、B2/C2之间有明显差异,P<0.01;B3/C3、B4/C4之间有统计学差异,P<0.05。组内比较结果如下:B1/B2、B1/B3、B1/B4、B2/B3、B2/B4、B3/B4之间均无统计学意义,P>0.05;C3/C4之间无明显差异,P>0.05,C1/C2、C1/C3、C1/C4、C2/C3、C2/C4之间均有统计学差异, P<0.05。结论:1尼莫地平可减少全脑缺血-再灌注后海马区细胞凋亡,其作用机制可能与早期上调Bcl-2蛋白表达有关,并受到Bcl-2/Bax比值的调控。2尼莫地平干预全脑缺血-再灌注损伤早期应用效果较好。
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