真鲷肌肉中蛋白酶及其抑制剂的研究

论文摘要

蛋白酶及其内源性抑制剂在细胞和生物体的生命活动过程中起着十分重要的作用，在生产实践中也具有广泛的用途。鱼类作为动物中最丰富的物种之一，为人类提供优质蛋白质资源。鱼类肌肉蛋白代谢和死后储藏过程中的降解等生化变化与其内源性蛋白酶和抑制剂密切相关，而这些变化又直接影响鱼肉的品质。因此，对鱼类蛋白及其内源性抑制剂的研究具有重要的理论意义和潜在的应用价值。本文以海水鱼真鲷为研究对象，对其肌肉中三种蛋白酶和一种内源性蛋白酶抑制剂进行了研究，为阐明鱼类肌肉蛋白新陈代谢机制、鱼死后肌肉软化机理等提供实验依据和理论参考。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤、羟基磷灰石层析和Phenyl-Sepharose疏水层析等5步纯化，首次从海水名贵鱼真鲷肌肉中纯化到一种亮氨酸氨肽酶（LAP）。LAP是一种结合Zn2+和（或）Mn2+的金属蛋白酶，分子量为96 kDa，酶的最适温度和最适pH分别为40℃和7．5。37℃下对荧光底物Leu-MCA分解的米氏常数Km和kcat值分别为1．55μmol／L和26．4s-1，水解反应的活化能（Ea）为59．6 kJ／mol。蛋白酶抑制剂Bestatin对LAP表现为竞争性抑制作用，抑制常数（KI）为1．44μmol／L。Zn2+和Cd2+对真鲷LAP的抑制作用类型均为混合型抑制，抑制常数（KI）分别为3．54 mmol／L和0．92mmol／L，对酶-底物络合物的抑制常数(KIS)则分别为4．49 mmol／L和5．9 mmol／L。亮氨酸、色氨酸和苯丙氨酸对LAP的抑制均为竞争性抑制作用，其抑制常数（KI）分别为0．54、0．21和1．19 mmol／L；半胱氨酸对LAP为混合型抑制效应，抑制常数KI为0．26 mmol／L，对酶-底物络合物的抑制常数KIS为9．43 mmol／L。利用制备的兔抗真鲷LAP多克隆抗血清进行免疫组化分析表明，LAP在真鲷肌肉细胞的胞质内主要呈点状小颗粒样分布，免疫学检测表明在真鲷不同组织器官中广泛分布有LAP。此外，LAP在鲤鱼、鲫鱼、草鱼、鲢鱼、胡子鲶和蓝园鲹等鱼类肌肉中都有存在。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephacel离子交换、Phenyl-Sepharose疏水层析和羟基磷灰石层析，从真鲷肌肉中纯化到一种具有分解明胶能力的丝氨酸蛋白酶（SP）。SP的分子量为85 kDa，酶的最适温度和最适pH分别为40℃和8．0。丝氨酸蛋白酶抑制剂可明显抑制SP活性，其他类型蛋白酶抑制剂对其活性没有明显影响。该蛋白酶对荧光合成底物Boc-Leu-Lys-Arg-MCA的米氏常数Km和kcat值分别为3．58μmol／L和0．13s-1。实验表明，SP与其它已报道的肌肉肌浆可溶性丝氨酸蛋白酶（MSSP）和肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶（MBSP）的酶学特性均有较明显差异，可能是一种具有独特酶学性质的新型丝氨酸蛋白酶。SP对明胶和真鲷Ⅰ型胶原蛋白具有明显分解能力，对真鲷肌球蛋白重链也有明显分解作用，推测其可能是参与鱼肉保鲜过程肌肉软化的一种重要蛋白酶。通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sephacel离子交换层析、Phenyl-Sepharose疏水层析和Gelatin-Sepharose亲和层析，从真鲷肌肉中纯化到一种依赖钙离子的金属蛋白酶（MP）。MP的分子量为52 kDa，酶的最适温度和最适pH分别为40℃和8．0，金属蛋白酶抑制剂可明显抑制其活性，其它蛋白酶抑制剂对MP活性则没有抑制作用。MP活性完全依赖Ca2+的存在，性质分析显示MP可能是一种类哺乳动物基质金属蛋白酶。MP对明胶和真鲷Ⅰ型胶原蛋白具有较明显的分解作用，对真鲷肌原纤维蛋白如肌球蛋白重链、肌动蛋白、α-辅肌动蛋白和伴肌动蛋白等具有明显分解作用，推测其很可能是引起鱼肉保鲜过程中肌肉软化的主要蛋白酶之一。利用分子克隆技术，从真鲷肌肉组织中克隆了类哺乳动物金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）编码成熟蛋白区域的基因序列，该基因序列为585bp，推导编码194个氨基酸残基，与来自真鲷囊胚细胞、牙鲆、斑马鱼、大西洋鲑鱼和人TIMP-2氨基酸序列同源性分别为100％、91％、80％、72％和70％，与人TIMP1，3和4的同源性均约为40％。通过基因工程技术，构建了重组酵母系统分泌性表达TIMP-2。在摇瓶培养状态下，rTIMP-2表达水平可达10 mg／L，用Ni-NTA亲和层析可一步高度纯化rTIM P-2。rTIMP-2对真鲷和鲤鱼肌肉肌浆金属蛋白酶有抑制作用，对明胶酶A样的基质金属蛋白酶抑制作用明显。鱼类肌肉中蛋白酶及其内源性抑制剂种类多样，功能各异，它们共同参与肌肉蛋白新陈代谢和鱼死后冷藏过程中的肌肉软化。本文以真鲷为研究对象，首次建立了三种不同类型蛋白酶（LAP、SP和MP）的纯化方法，对三种蛋白酶的生物化学特性、酶学性质等进行了研究；克隆并首次在酵母系统中表达了TIMP-2，对表达的重组蛋白性质进行了分析。本文研究结果为解析鱼类肌肉蛋白新陈代谢和死后肌肉软化机制提供了理论依据，对鱼类保鲜、加工也有潜在的应用价值。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写语对照表
• 第一篇 前言
• 1 蛋白酶的分离纯化
• 1.1 分离纯化特点
• 1.2 分离纯化原则
• 1.3 分离纯化方法
• 2 蛋白酶的分类
• 2.1 丝氨酸蛋白酶
• 2.2 金属蛋白酶
• 2.3 天冬氨酸蛋白酶
• 2.4 半胱氨酸蛋白酶
• 3 蛋白酶的应用
• 4 鱼类肌肉蛋白酶和鱼肉品质的关系
• 4.1 鱼类肌肉纤维特性
• 4.2 鱼死后肌肉变化
• 4.3 鱼类肌肉中的蛋白酶
• 5 本课题研究的意义、内容和目的
• 第二篇 材料与方法
• 1 材料
• 1.1 实验用鱼
• 1.2 试剂
• 1.3 菌株和载体
• 1.4 常用溶液
• 1.5 主要仪器
• 2 方法
• 2.1 蛋白酶活性的检测
• 2.1.1 真鲷亮氨酸氨肽酶（LAP）活性的检测
• 2.1.2 真鲷丝氨酸蛋白酶（SP）和金属蛋白酶（MP）活性的检测
• 2.2 蛋白浓度的测定
• 2.3 蛋白酶纯度的鉴定
• 2.4 蛋白酶的分离纯化
• 2.4.1 真鲷亮氨酸氨肽酶（LAP）的分离纯化
• 2.4.2 真鲷丝氨酸蛋白酶（SP）和金属蛋白酶（MP）的分离纯化
• 2.5 蛋白酶性质的研究
• 2.5.1 真鲷亮氨酸氨肽酶（LAP）的性质分析
• 2.5.2 真鲷丝氨酸蛋白酶（SP）的性质分析
• 2.5.3 真鲷金属蛋白酶（MP）的性质分析
• 2.6 亮氨酸氨肽酶（LAP）在鱼体内分布的免疫学检测
• 2.6.1 LAP多克隆抗体的制备
• 2.6.2 LAP在真鲷不同组织器官中的分布
• 2.6.3 LAP在不同鱼肌肉中的分布
• 2.6.4 LAP在真鲷肌肉细胞中的亚细胞定位
• 2.7 真鲷金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）的克隆、表达及性质分析
• 2.7.1 基因克隆和序列分析
• 2.7.2 重组酵母菌株的构建
• 2.7.3 重组酵母菌株的表达
• 2.7.4 rTIMP-2的纯化
• 2.7.5 rTIMP-2的性质分析
• 第三篇 结果与分析
• 1 真鲷亮氨酸氨肽酶（LAP）的研究
• 1.1 LAP的分离纯化
• 1.2 LAP的性质分析
• 1.2.1 LAP的分子量
• 1.2.2 糖基化检测
• 1.2.3 LAP催化反应动力学性质
• 1.2.4 蛋白酶抑制剂对LAP活性的影响及机理
• 1.2.5 金属离子对LAP活性的影响及机理
• 1.2.6 氨基酸对LAP活性的影响及机理
• 1.2.7 有机溶剂对LAP活性的影响
• 1.3 LAP在鱼体内分布的免疫学检测
• 1.3.1 LAP多克隆抗体的制备
• 1.3.2 LAP在真鲷不同组织器官中的分布
• 1.3.3 LAP在不同鱼肌肉中的分布
• 1.3.4 LAP在真鲷肌肉细胞中的亚细胞定位
• 2 真鲷丝氨酸蛋白酶（SP）和金属蛋白酶（MP）的研究
• 2.1 SP和MP的分离纯化
• 2.2 SP的性质分析
• 2.2.1 分子量
• 2.2.2 分解荧光底物特性
• 2.2.3 最适温度和最适pH
• 2.2.4 蛋白酶抑制剂对SP活性的影响
• 2.2.5 金属离子对SP活性的影响
• 2.2.6 氨基酸对SP活性的影响
• 2.2.7 动力学参数
• 2.2.8 SP对真鲷Ⅰ型胶原蛋白的分解
• 2.2.9 SP对明胶的分解
• 2.2.10 SP对牛血清白蛋白的分解
• 2.2.11 SP对真鲷肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的分解
• 2.3 MP的性质分析
• 2.3.1 分子量
• 2.3.2 最适温度和最适pH
• 2.3.3 蛋白酶抑制剂对MP活性的影响
• 2.3.4 金属离子对MP活性的影响
• 2.3.5 氨基酸和DTT对MP活性的影响
• 2.3.6 MP对真鲷Ⅰ型胶原蛋白的分解
• 2.3.7 MP对明胶的分解
• 2.3.8 MP对真鲷肌原纤维蛋白和肌浆蛋白的分解
• 3 真鲷金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）的克隆、表达及性质分析
• 3.1 基因克隆和序列分析
• 3.1.1 基因克隆
• 3.1.2 序列分析
• 3.2 重组酵母菌株的构建和表达
• 3.2.1 重组酵母菌株的构建
• 3.2.2 重组酵母菌株的表达
• 3.3 rTIMP-2的纯化
• 3.4 rTIMP-2的性质分析
• 3.4.1 Western blot
• 3.4.2 分子量
• 3.4.3 抑制剂特性分析
• 第四篇 讨论与结论
• 1 亮氨酸氨肽酶（LAP）的讨论
• 1.1 LAP的分离纯化
• 1.2 LAP的性质
• 2 丝氨酸蛋白酶（SP）和金属蛋白酶（MP）的讨论
• 2.1 SP和MP的分离纯化
• 2.2 SP的性质
• 2.3 MP的性质
• 3 金属蛋白酶组织抑制剂2（TIMP-2）的讨论
• 3.1 TIMP-2的克隆及重组表达
• 3.2 rTIMP-2的性质
• 4 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录