HCCB10124抗真菌活性的初步研究

论文摘要

本论文利用上海来益生物药物研发中心筛选得到的一株产广谱、高活性抗真菌产物的HCCB10124菌株,通过纸敏片法测定抗菌谱,发现其对20余种真菌,其中有些是植物和动物的病原菌,有显著拮抗作用,另外,对金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌也有抑制作用;并对对菌丝体提取物进行不同浓度稀释,进行抗真菌活性的测定,发现活性很高。根据16SrDNA序列分析,该菌株与链霉菌Streptomyces albireticuli具有99%的序列同源性。在分离纯化之前,对链霉菌HCCB10124进行发酵条件和培养基成分进行初步优化,以期获得较高产量的活性代谢产物。优化后培养基基本组成成分为:2%葡萄糖、2%可溶性淀粉、4%药媒、0.04%钼酸铵、0.4%的碳酸钙。检测了菌丝体提取物及发酵液上清中生物活性产物对温度、pH值的稳定性;利用捷克八溶剂系统纸色谱的方法对生物活性产物进行了研究,发现其对温度、pH值较稳定。初步的研究结果为进一步分离提取打下一定的基础。通过pH沉淀、有机溶剂萃取和树脂吸附、硅胶柱层析、中压色谱层析等实验,确定的工作流程为先将发酵上清液的pH调至6除去离心未除去的固形物,以大孔吸附树脂吸附上清液和菌丝体丙酮抽提液,除去色素,不同浓度的乙醇洗脱,洗脱液浓缩,进行硅胶柱层析,以丙酮:甲醇=10:1、5:1、3:1、2:1、1:1、100%甲醇分段洗脱,充分除去色素,对活性物质进行初步分离。最后,用中压色谱进行实验,除去部分杂质,达到对样品富集和纯化的目的。鉴于链霉菌HCCB10124所产抗真菌物质具有广谱、高活性、高稳定性等优点,因此具有潜在的、重要的应用价值和理论意义。其所产抗菌活性物质有望开发为一种可广泛地应用于真菌病害的生物防治或人畜真菌性疾病的抗真菌抗生素。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 作用于真菌细胞膜合成的抗真菌药物
• 1.1 唑类抗真菌药物作用机制
• 1.2 烯丙胺类抗真菌药物作用机制
• 1.3 作用于真菌细胞膜中甾醇合成的多烯类抗真菌抗生素作用机制
• 2 作用于真菌细胞壁合成的抗真菌抗生素
• 2.1 作用于真菌细胞壁中葡聚糖合成的抗真菌抗生素
• 2.2 作用于真菌细胞壁中几丁质合成的抗真菌抗生素
• 2.3 以细胞壁中甘露聚糖为作用靶位的抗真菌抗生素
• 3 抑制蛋白质合成的抗真菌抗生素
• 4 作用于核酸合成的抗真菌药物
• 4.1 抗真菌合成药物5-氟胞嘧啶
• 4.2 抗真菌抗生素灰黄霉素
• 5 结语
• 6 本课题研究内容、目的及意义
• 第二章 HCCB10124 固体及液体培养物抗真菌活性的测定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 主要实验试剂
• 1.1.3 主要实验仪器与设备
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 活化菌种
• 1.2.2 平板琼脂移块法测定HCCB10124抗菌谱
• 1.2.3 菌丝体提取物与发酵液抗真菌活性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 平板琼脂移块法测定抗菌谱
• 2.2 菌丝体提取物及发酵液抑菌实验结果
• 2.3 不同浓度菌丝体提取物的抗菌活性实验
• 3 讨论
• 第三章 HCCB10124 菌种鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 菌体形态特征观察
• 1.2.2 菌株HCC810124 的分子鉴定
• 1.2.2.1 染色体DNA的提取
• 1.2.2.2 PCR扩增引物的合成
• 1.2.2.3 16S rDNA 的 PCR 扩增体系
• 1.2.2.4 PCR扩增条件
• 1.2.2.5 系统发育分析
• 2 结果与分析
• 2.1 形态特征观察结果
• 2.2 16SrDNA 序列分析结果
• 2.3 菌株 HCCB10124 的系统发育分析及鉴定结果
• 3 讨论
• 第四章 菌株 HCCB10124 培养条件的优化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要实验试剂
• 1.1.2 主要实验仪器与设备
• 1.1.3 菌株
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 种子培养
• 1.2.2 发酵条件优化设计
• 1.2.3 培养基成分的优化
• 2 结果与分析
• 2.1 发酵条件对发酵产物活性的影响
• 2.1.1 培养基初始pH值对发酵产物活性的影响
• 2.1.2 培养时间对发酵产物活性的影响
• 2.1.3 培养温度对发酵产物活性的影响
• 2.1.4 摇床转速对发酵产物活性的影响
• 2.2 培养基成分优化
• 2.2.1 不同的碳源对发酵产物活性的影响
• 2.2.2 不同的氮源对发酵产物活性的影响
• 2.2.3 不同的无机盐对发酵产物活性的影响
• 2.2.4 正交实验设计及代谢产物活性
• 3 讨论
• 第五章 抗真菌活性代谢产物的初步研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 菌种
• 1.1.2 培养基
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 主要实验仪器与设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 一般性质
• 1.2.2 抗真菌活性物质的初步分离
• 2 结果与分析
• 2.1 一般性质
• 2.1.1 pH对活性物质稳定性的影响
• 2.1.2 温度对活性物质稳定性的影响
• 2.1.3 薄层层析法分离和鉴别抗生素
• 2.1.4 抗真菌物质的紫外吸收
• 2.1.5 八溶剂系统纸层析法鉴别抗生素
• 2.2 抗真菌活性物质初步分离结果
• 2.2.1 pH沉淀实验结果
• 2.2.2 有机溶剂萃取实验结果
• 2.2.3 HP-20 树脂柱层析结果
• 2.2.4 硅胶柱层析结果
• 2.2.5 中压层析结果
• 3 讨论
• 论文小结
• 致谢
• 参考文献
• 附件