重组人β-防御素-3基因在小鼠乳腺中表达的初步研究

论文摘要

防御素是近年来发现的一种内源性多肽,在肌体免疫中发挥着重要作用,对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌、甚至是病毒都具有很强的抑杀作用,并且分子量小、热稳定好、水溶性强、无免疫原性,具有独特的研究和开发价值。人β-防御素-3（hBD3）是2001年发现的第三种人源性β防御素,与其他防御素相比,在抗菌活性方面具有明显的优势,对革兰氏阳性菌和阴性菌具有强烈的杀灭作用,是所有抗菌肽中抗菌能力最强少数几种之一,只要几微克/毫升就可杀灭葡萄球菌、大肠杆菌、芽胞杆菌等,有很强的应用价值。我们曾使其在大肠杆菌中得到了高效表达,但是需要复性才能有活性,与传统的原核表达系统相比,应用动物乳腺生产重组蛋白产品具有生产成本低、产量大,表达产物的生物活性高、产品易于纯化等优点。本研究通过PCR克隆了牛β-酪蛋白（β-CN）基因5′调控区和hBD3的基因组序列,并构建了hBD3的真核表达载体pcDNA3.1（+）-hBD3,将此重组质粒注射到泌乳期小鼠乳腺内,进行初步的表达和活性检测。在此基础上,进一步构建牛β-CN基因5′调控区和hBD3的重组克隆载体,以实现在小鼠乳腺中的特异表达。具体试验结果如下:1.hBD3基因的克隆根据GenBank中NT077531序列设计了一对引物,运用PCR技术,以人基因组DNA为模板,扩增了约1392bp的基因片段并把它克隆到pMD18-T载体上,构建的重组质粒pMD18-hBD3经PCR、酶切及序列测定表明,插入的序列与NT077531公布的hBD3基因同源性达到99.93%。2.牛β-CN基因5′调控区的克隆根据GenBank中X14711序列设计一对引物,运用PCR技术,以奶牛基因组DNA为模板,扩增了约2334bp的奶牛β-酪蛋白5′调控区。测序结果表明所得序列与X14711的同源性达98.29%。奶牛β-酪蛋白基因5′调控区的克隆为进一步构建乳腺特异表达载体奠定了基础。3.hBD3基因在小鼠乳腺中的表达将pMD18-hBD3用KpnI和XbaI双酶切,回收小片段,定向克隆至经同样酶切处理的质粒pcDNA3.1（+）,构建表达载体pcDNA3.1（+）-hBD3,经PCR和双酶切鉴定,结果表明,hBD3基因已正确插入到真核表达pcDNA3.1（+）中,分别把纯化后的空载质粒pcDNA3.1和表达质粒pcDNA3.1（+）-hBD3按25μg/次/乳头的剂量直接注射到泌乳期小鼠乳腺体内,然后取其乳汁,用琼脂糖平板溶圈法检测hBD3的活性,结果表明,试验组和对照组无明显差异。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 人防御素研究进展
• 1.1.1 人防御素的分布
• 1.1.2 人防御素的分子生物学特征
• 1.1.2.1 人防御素的分子结构
• 1.1.2.2 人防御素在染色体上的定位及基因结构
• 1.1.2.3 人防御素的抗菌活性
• 1.1.2.4 人防御素基因的表达调控
• 1.1.3 人防御素的作用机理
• 1.1.4 人防御素的基因工程
• 1.1.4.1 人防御素在原核细胞中的表达
• 1.1.4.2 人防御素在真核细胞中的表达
• 1.2 乳腺生物反应器
• 1.2.1 乳腺生物反应器的构建
• 1.2.1.1 表达载体的构建
• 1.2.2 常用的基因转移技术
• 1.2.2.1 显微注射法
• 1.2.2.2 反转录病毒感染技术
• 1.2.2.3 胞内精子微注射技术
• 1.2.2.4 ES细胞介导技术
• 1.2.3 乳腺生物反应器的应用现状
• 1.2.4 问题与展望
• 2 引言
• 3 人β防御素3基因的克隆及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 实验方法
• 3.1.2.1 PCR引物的设计与合成
• 3.1.2.2 PCR反应
• 3.1.2.3 PCR产物的回收和纯化
• 3.1.2.4 感受态细胞的制备
• 3.1.2.5 PCR产物的克隆
• 3.1.2.6 重组质粒的转化
• 3.1.2.7 重组质粒pMD18-hBD3的筛选与鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 hBD3的PCR扩增结果
• 3.2.2 重组质粒pMD18-hBD3的筛选与鉴定
• 3.2.2.1 PCR 鉴定
• 3.2.2.2 酶切鉴定
• 3.2.2.3 测序鉴定
• 3.3 结论与讨论
• 4 牛β酪蛋白基因5′端的克隆及序列测定
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.1.2.1 PCR引物的设计与合成
• 4.1.2.2 牛血液DNA的提取
• 4.1.2.3 PCR反应
• 4.1.2.4 PCR产物的回收和纯化
• 4.1.2.5 感受态细胞的制备
• 4.1.2.6 PCR产物的克隆
• 4.1.2.7 重组质粒的转化
• 4.1.2.8 转化菌的筛选与鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 提取血液基因组DNA
• 4.2.2 牛β-CN基因5′调控区的PCR扩增
• 4.2.3 重组质粒pMD18-βCN与鉴定
• 4.2.3.1 PCR鉴定
• 4.2.3.2 酶切鉴定
• 4.2.3.3 测序鉴定
• 4.3 结论与讨论
• 5 hBD3基因真核表达载体的构建及在小鼠乳腺中的初步表达
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 实验方法
• 5.1.2.1 人β防御素3基因片段的制备
• 5.1.2.2 双酶切产物的纯化和回收
• 5.1.2.3 表达载体pcDNA3.1（+）-hBD3 的构建
• 5.1.2.4 表达载体pcDNA3.1（+）-hBD3的筛选与鉴定
• 5.1.2.5 注射用质粒DNA的制备
• 5.1.2.6 注射小鼠乳腺
• 5.1.2.7 乳汁的采取
• 5.1.2.8 乳汁中人β防御素3的检测
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 重组表达质粒pcDNA3.1-hBD3的构建
• 5.2.2 重组质粒pcDNA3.1（+）-hBD3的鉴定
• 5.2.3 人β防御素3基因的表达和活性检测
• 5.3 结论与讨论
• 本文小结
• 参考文献
• ABSTRACT
• 附件1 克隆的人防御素3与GenBank公布序列比对结果
• 附件2 克隆的牛β-酪蛋白基因5′端调控序列与GenBank公布的序列比对结果