论文摘要
牛海绵样脑病（bovine spongifom encephalopathy，BSE）、人的变异性克-雅氏病（Creuzfeldt Jakob Disease）、阿尔茨海默症（Alzheimer’s disease，AD）及绵羊瘙痒病（Scrapie），是动物和人常见的一类中枢神经系统退行性疾病；其主要病理特征为脑部组织发生淀粉样病变。淀粉样蛋白假说认为β淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）的积累是这类海绵样脑病的固有特征和发病的主要原因。Aβ的产生是由β淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）经过β-分泌酶（β-secretase）和γ-分泌酶（γ-secretase）顺序剪切；其中γ-分泌酶的剪切作用尤为关键。脑淀粉样病变的分型较多，例如AD的发生分为散发型和家族型两类，绝大部分AD病例是散发型，主要由遗传和环境等多种因素综合所致。目前，以研究遗传因素影响γ-分泌酶的活性和检测淀粉样蛋白产生为主；而环境因素是否能影响γ-分泌酶的活性和β淀粉样蛋白的产生尚不清楚。因此，本实验通过建立急性应激动物模型，研究急性应激因素影响实验动物脑淀粉样病变的发生与发展。主要研究内容如下：1．急性应激动物模型建立根据Gene Bank数据库公布中C-FOS基因序列，设计引物。以C57小鼠为研究材料，把小鼠放置于固定束缚装置中，2小时后，从固定装置中取出，急性应激组小鼠表现为疏毛增多，敏感、烦躁，易激怒，毛发蓬松，缺乏光泽。处死小鼠，在冰上取小鼠肝脏．提取总RNA，经RT—PCR获得cDNA，然后对cDNA进行荧光定量PCR，并据其结果计算比较应激组与对照组小鼠肝脏中C-FaY基因的mRNA水平。结果发现，急性应激组的小鼠肝脏中C-FOS基因的mRNA水平是对照组的4倍。2．夹心酶联免疫法检测急性应激C57小鼠海马中Aβ水平对C57小鼠进行急性应激后，在冰上采集小鼠海马，提取海马组织蛋白，然后ELISA检测急性应激后小鼠海马组织中Aβ水平；同时设有阴性对照和阳性标准，在波长为Em=495nm下，M5酶标仪检测荧光底物受到激发产生的荧光值。通过阳性蛋白的标准曲线可以得出，急性应激组小鼠海马中Aβ40和Aβ42的浓度分别为1.68和1.7nmol／L；而对照组小鼠海马中Aβ40和Aβ42的浓度分别为1.01和1.0nmol／L。可见急性应激小鼠的海马组织中无论是Aβ40还是Aβ42的水平，都显著高于对照组（p＜0.01）；然而，用同样的方法检测小鼠前额叶皮层中Aβ40和Aβ42的水平，则发现在急性应激组和对照组小鼠的前额叶皮层中Aβ40和Aβ42的浓度同为1.0nmol／L几左右，无显著性差异。3．荧光底物实验测定应激c57小鼠海马组织中γ-分泌酶的活性取急性应激小鼠的海马和前额叶皮层并组织匀浆，低速离心，取上层液，蛋白定量后，用胰岛素针将细胞膜抽吸6至8次，机械破碎细胞膜，然后15，000rpm／min离心，弃上清液，向沉淀物加入荧光底物的缓冲液，37℃水浴2小时后，在波长Ex=355nm，Em=440nm下，M5酶标仪检测荧光值，并对产物激发荧光进行计量。急性应激组小鼠海马中γ-分泌酶荧光值为95.4；对照组小鼠海马中γ-分泌酶荧光值为65.2；而空白对照（无蛋白，仅有荧光底物）的荧光值为53.7。故急性应激组小鼠海马中γ-分泌酶的活性比对照组小鼠海马中γ-分泌酶的活性增强约60％。同样方法检测了急性应激组小鼠和对照组小鼠的前额叶皮层中γ-分泌酶的荧光值，结果发现两者的荧光值均约为60.3。表明急性应急对小鼠前额叶皮层中的γ-分泌酶的活性没有明显影响。为验证急性应激是否仅仅是通过改变γ-分泌酶的活性来调控Aβ的产生，因此，本试验同样利用荧光底物试验检测α-分泌酶与β-分泌酶的活性。结果显示，无论是应激组和对照组的海马中还是在前额叶皮层中，α-分泌酶与β-分泌酶的活性都没有明显的变化。4．Western blot检测急性应激C57小鼠海马组织中tau蛋白的磷酸化水平C57小鼠经急性应激后，在冰上取小鼠海马组织，用抽提组织蛋白的试剂盒，提取蛋白，对提取的蛋白进行10％聚丙烯酰胺凝胶电泳；然后将经过凝胶分离的蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用抗磷酸化tau蛋白抗体进行Western blot，检测小鼠海马中蛋白中的磷酸化水平。经Adobe Photo shop软件统计Western blot结果，统计结果显示，急性应激小鼠海马中磷酸化tau蛋白的条带的灰度值为4.56；而对照组小鼠海马中磷酸化tau蛋白的条带的灰度值为1.48，急性应激组小鼠海马细tau蛋白的磷酸化水平是对照组的3倍左右，表明急性应激引起小鼠海马tau蛋白的磷酸化水平明显升高。