胶体金速测卡研制及柑橘溃疡病菌快速诊断

论文摘要

柑橘溃疡病（Citrus bacterial canker disease,CBCD）是一种由柑橘黄单胞菌（Xanthomonas citri pv.citri,Xcc）所引起的,危害全世界柑橘种植业最严重的检疫性细菌病害。该病能侵染绝大多数多种芸香科植物,包括柑橘属的绝大多数商品化栽培品种。该病主要随带病种苗等繁殖材料远距离传播,发病严重时往往导致树势衰退,枯枝落叶、布满病斑、果实品质恶劣甚至未熟先落,严重影响柑橘的产量和质量。由于抗病品种和特效药剂的匮乏,针对发病植株仍采用挖除病树集中烧毁的铲除方式。目前对该病的防控措施主要依靠加强植物检疫检测,早期诊断病害,切断传播源头。随着我国经济快速发展,柑橘产品的调运和交易更加频繁,人为传播的危险性急剧加大,在这样的形势下迫切需要更多更好的检测技术手段,特别是快速简便、可用于现场诊断的方法。胶体金溶液分散相中的金原子直径在l150nm之间,随着颗粒大小的不同溶胶颜色呈现由红到紫的变化。胶体金免疫技术（ICG）是以胶体金颗粒作为显色物质或示踪标记物,标记于抗原或抗体上,直观反映抗原抗体之间相互作用的新型免疫标记技术。胶体金颗粒本身无毒,能够迅速而稳定地吸附于所有生物大分子上,但不改变大分子的生物活性,因此作为一种安全的探针它可以进行切片定位及日常诊断技术。其优点是快速、灵敏、特异性强、稳定性好,且操作简便、无需任何仪器设备,结果判断直观可靠、易被基层人员掌握。因而在电镜、免疫印迹、体外诊断试剂盒的制造、药物残留测试、临床疾病诊断等等领域都得到了广泛的应用。本研究针对柑橘溃疡病菌现有检测技术在基层田间难于进行现场快速诊断的缺陷,利用重庆大学基因工程研究中心前期筛选的重组抗体,制备并比较单克隆抗体、多克隆抗体与重组抗体的实际应用性能,研发柑橘溃疡病菌快速诊断胶体金速测卡,可望为柑橘溃疡病菌的诊断提供一种简便、快速、便于基层使用的检测手段。主要研究结果如下:①将制备并提纯的抗Xcc单克隆抗体、多克隆抗体及重组抗体,采用间接ELISA方法对比,筛选出两株特异性强、稳定性好的抗体（Xcc-2D8和Xcc-2D6效价均为1:128,000以上）,应用于胶体金速测卡的研发。②采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,所制金溶胶状态为鲜红透亮,离心无挂壁无黑色颗粒沉淀。通过紫外400600nm扫描,吸收峰宽小,粒子分布均匀,最大吸收峰波长在520nm左右,为标记所需颗粒大小。③通过pH梯度测定金标抗体最适pH标记范围在9.09.5左右。通过抗体浓度梯度测定金颗粒最适添加抗体量在20mg/mL以上。④确定各类层析材料以及各层析材料的预处理方式。金标抗体固定于金标垫上;利用双抗夹心原理,将检测抗体（Xcc-2D6）和二抗抗体（山羊抗小鼠IgG）分别固定于硝酸纤维素膜上,作为检测线（T线）和质控线（C线）,经实验条件优化,组装胶体金速测卡密封干燥保存。⑤用Xcc菌悬液及柑橘样本浸后液对所制胶体金速测卡进行检测评价。速测卡对Xcc菌悬液的检测下限为1×1034cfu/mL,对多个地区的206份柑橘样本进行实际检测所得结果与qPCR方法所得结果具有较高一致性（kappa值=95.15%）,检测时间控制在10分钟以内,对其他植物致病菌、柑橘伴生菌及常见细菌无交叉反应,说明胶体金速测卡特异性良好,各批次间速测卡无差异,保存稳定。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 柑桔溃疡病菌简介
• 1.1.1 发生与危害
• 1.1.2 柑橘溃疡病菌的菌系与分类研究
• 1.2 柑桔溃疡病菌研究进展及研究热点
• 1.2.1 基因组及抗病机理研究
• 1.3 现有检测技术及发展
• 1.3.1 常规检验法
• 1.3.2 免疫学检测方法
• 1.3.3 常规PCR 检测技术
• 1.3.4 实时荧光定量qPCR 方法
• 1.4 胶体金免疫技术
• 1.4.1 胶体金免疫层析法的基本原理
• 1.4.2 胶体金免疫快速诊断技术的应用现况
• 1.5 研究的目的和意义
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究的意义
• 1.6 研究内容和技术路线
• 1.6.1 研究内容
• 1.6.2 技术路线
• 1.7 本研究的创新之处
• 2 材料与方法
• 2.1 主要仪器
• 2.2 主要试剂及耗材
• 2.3 柑橘溃疡病菌抗原的制备
• 2.4 抗体的制备
• 2.4.1 多克隆抗体的制备
• 2.4.2 重组抗体的表达及纯化
• 2.4.3 单克隆抗体的制备
• 2.5 抗体特性评价及筛选
• 2.5.1 特异性测试
• 2.5.2 灵敏度测试
• 2.5.3 稳定性测试
• 2.6 胶体金颗粒的制备
• 2.6.1 玻璃器皿的前处理
• 2.6.2 制备胶体金
• 2.6.3 紫外扫描鉴定
• 2.7 金标抗体的制备
• 2.7.1 胶体金颗粒与抗体结合最适pH 范围
• 2.7.2 金标抗体最适标记量
• 2.7.3 金标抗体的制备及纯化
• 2.8 速测卡材料处理及优化
• 2.8.1 金标垫的制备
• 2.8.2 硝酸纤维素膜的处理
• 2.8.3 胶体金速测卡的组装及结果判断
• 2.9 速测卡性能分析及评价
• 2.9.1 特异性分析
• 2.9.2 灵敏度分析
• 2.9.3 稳定性分析
• 2.9.4 批次间差异性性分析
• 2.9.5 速测卡法与qPCR 法结果一致性分析
• 3 结果与分析
• 3.1 抗体特性评价
• 3.1.1 抗体特异性测试
• 3.1.2 抗体灵敏度测试
• 3.1.3 抗体稳定性测试
• 3.2 胶体金颗粒的制备
• 3.3 金标抗体的制备及纯化
• 3.3.1 胶体金颗粒与抗体结合最适pH 范围
• 3.3.2 胶体金颗粒最适加入抗体标记量
• 3.4 速测卡材料处理及优化
• 3.4.1 金标垫的制备
• 3.4.2 硝酸纤维素膜的处理
• 3.5 速测卡性能分析及评价
• 3.5.1 速测卡特异性测试
• 3.5.2 速测卡灵敏度检测
• 3.5.3 速测卡稳定性测试
• 3.5.4 速测卡批间重复性检测
• 3.5.5 qPCR 方法检测结果
• 3.5.6 速测卡法检测
• 3.5.7 速测卡与qPCR 法结果一致性分析
• 4 讨论
• 4.1 多克隆抗体的制备
• 4.2 抗体的特性及评价
• 4.3 胶体金颗粒的制备
• 4.4 金标抗体最适pH
• 4.5 层析材料的选择
• 4.6 测试卡性能评价
• 5 结论及后续工作
• 5.1 主要研究结论
• 5.2 后续工作思路
• 致谢
• 参考文献
• 附录