北京油鸡骨髓间充质干细胞和胚胎生殖细胞重要生物学特性研究

论文摘要

本试验对北京油鸡胚胎生殖细胞和骨髓间充质干细胞的分离、培养、生物学特性鉴定、外源基因导入及诱导分化进行了初步探索和研究，得出了以下结果：1．采用全血贴壁或密度梯度离心法分离30～60日龄鸡胫骨的骨髓间充质干细胞，经筛选、扩增，在体外培养传至第7代。骨髓间充质干细胞为贴壁生长，形态大多为纺锤形。少量多角形、圆形。细胞生长曲线呈“S”型，细胞群体倍增时间约36h。本试验共冻存8个个体的骨髓间充质干细胞，25支冻存管。冻存前、复苏后细胞活率分别为98％、87.5％。2．北京油鸡骨髓间充质干细胞核型分析统计结果二倍体染色体数目为2n=78±，符合北京油鸡的种属特性，遗传性能稳定：组织化学检测糖原检测呈阳性、碱性磷酸酶检测呈阴性、苏丹Ⅲ染色呈阴性。符合MSCs的组织化学特征：免疫荧光检测显示北京油鸡MSCs表达细胞表面标志CD44、CD54、SSEA-4，不表达CD34、CD45、SSEA-1、c-kit，和其他物种的骨髓间充质干细胞相似；微生物检测结果均为阴性。3．脂质体介导pEGFP-C1基因转染骨髓间充质干细胞，转染后48h～96h阳性细胞明显增多、强度增强，1周内有较强表达，转染率最高可达40％。4．体外培养鸡骨髓间充质干细胞在地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸诱导下，以及与骨组织共培养条件下，分化为成骨细胞，具有成骨细胞的形态特征，碱性磷酸酶活性提高，茜素红、四环素标记检测呈阳性。5．分离孵化5.5d鸡胚生殖腺中的原始生殖细胞，原代与生殖腺细胞共培养，继代采用鼠胚成纤维细胞饲养层培养，获得的胚胎生殖细胞克隆体外培养传至第7代。北京油鸡胚胎原始生殖细胞含大的细胞核和相对较少的胞质，核仁不明显；胚胎生殖细胞克隆呈规则的岛状或其他集落状生长，多层分布。本实验共冻存10个个体胚胎生殖细胞，30支冻存管。冻存前、复苏后细胞活率分别为93.5％、74.7％。6．北京油鸡胚胎生殖细胞经染色体核型分析、细胞组织化学鉴定、免疫荧光检测、微生物检测，证明所培养细胞为胚胎生殖细胞，符合北京油鸡的种属特性，遗传性能稳定；培养物生长状态良好，未受细菌、真菌、支原体污染。7．脂质体介导pEGFP-N3荧光蛋白报告质粒转染鸡原始生殖细胞．转染后24h阳性细胞最多，转染表达率约为18.4％。8．体外培养胚胎生殖细胞克隆可在维甲酸诱导下分化形成类胚体及多种形态细胞；添加地塞米松、β-磷酸甘油、抗坏血酸后可诱导分化为成骨细胞，茜素红染色呈阳性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略表
• 第一章 引言
• 1.1 骨髓间充质干细胞及胚胎原始生殖细胞研究进展
• 1.1.1 干细胞的分离培养
• 1.1.2 干细胞的形态特征及鉴定
• 1.1.3 干细胞的多项分化潜能
• 1.1.4 干细胞的基因修饰
• 1.1.5 干细胞的应用前景
• 1.2 我国畜禽遗传资源保存概况
• 1.2.1 畜禽遗传资源概况
• 1.2.2 地方畜禽遗传资源保存技术
• 1.2.3 干细胞与遗传资源保存利用
• 第二章 北京油鸡骨髓间充质干细胞生物学特性研究
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验动物
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 间充质干细胞的分离培养
• 2.2.2 细胞生物学特性检测
• 2.2.3 外源基因转染间充质干细胞
• 2.2.4 间充质干细胞体外成骨诱导分化研究
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 两种方法分离MSCs的比较
• 2.3.2 细胞形态学
• 2.3.3 生长动力学
• 2.3.4 核型分析
• 2.3.5 微生物污染检测
• 2.3.6 细胞组织化学鉴定
• 2.3.7 细胞表面标志免疫荧光检测
• 2.3.8 外源基因转染间充质干细胞
• 2.3.9 间充质干细胞体外成骨诱导分化研究
• 2.4 讨论
• 2.4.1 骨髓间充质干细胞的分离
• 2.4.2 细胞形态及生长特性
• 2.4.3 间充质干细胞的鉴定
• 2.4.4 绿色荧光蛋白基因转染间充质干细胞
• 2.4.5 间充质干细胞成骨诱导分化研究
• 第三章 北京油鸡胚胎生殖细胞生物学特性研究
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 实验动物
• 3.1.2 主要试剂及其配制
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 饲养层的制备与处理
• 3.2.2 鸡胚PGCs的分离培养
• 3.2.3 鸡胚胎生殖细胞生物学特性检测
• 3.2.4 荧光蛋白基因转染鸡胚胎生殖细胞
• 3.2.5 鸡胚胎生殖细胞诱导分化研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 细胞生长行为特征
• 3.3.2 核型分析
• 3.3.3 微生物污染检测
• 3.3.4 组织化学鉴定
• 3.3.5 细胞表面标志免疫荧光检测
• 3.3.6 外源基因转染胚胎生殖细胞
• 3.3.7 胚胎生殖细胞的诱导分化
• 3.4 讨论
• 3.4.1 影响PGCs分离与培养的因素
• 3.4.2 EG的生物学特性鉴定
• 3.4.3 外源基因导入EG
• 第四章 全文结论
• 4.1 北京油鸡骨髓间充质干细胞生物学特性研究
• 4.2 北京油鸡胚胎生殖细胞生物学特性研究
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历